張書卿，張緒亮，張博，洪亮

E-鈣黏蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌關(guān)聯(lián)性的Meta分析

張書卿，張緒亮，張博，洪亮

目的將既往有關(guān)E-鈣黏蛋白（CDH1）基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌關(guān)系的研究進(jìn)行Meta分析，評估CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌的具體關(guān)聯(lián)。方法參照Cochrane協(xié)作網(wǎng)制定的檢索策略在國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，篩選并納入文獻(xiàn)后，提取文獻(xiàn)信息：第一作者、文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間、國家、語種、研究設(shè)計(jì)、樣本量、種族、病理亞型、甲基化檢測方法、基因甲基化頻率等。采用STATA12.0進(jìn)行Meta分析，計(jì)算優(yōu)勢比（OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI）。結(jié)果本Meta分析共計(jì)納入10項(xiàng)病例對照研究，通過檢測其中620例膀胱癌組織和341例正常或癌旁組織的CDH1基因甲基化頻率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中的甲基化頻率明顯高于正常或癌旁組織（OR=3.09，95%CI：1.13～8.50，P=0.029）；亞組分析結(jié)果顯示，在亞洲人群中膀胱癌組織中的甲基化頻率明顯高于正?；虬┡越M織（OR= 3.85，95%CI：1.46～10.14，P=0.006），而在歐美人群中未發(fā)現(xiàn)此種差異（OR=2.22，95%CI：0.38～12.91，P=0.375）；采用MSP方法檢測時(shí)，膀胱癌組織與癌旁及正常組織間CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率存在明顯差異（P＜0.001），采用Q-MSP方法檢測時(shí)，兩組CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率無明顯差異（P=0.818）。結(jié)論CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能參與了膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。

E-鈣黏蛋白；甲基化；膀胱癌；Meta分析

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有多發(fā)、高復(fù)發(fā)、預(yù)后差等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命，成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。在初次就診的膀胱癌患者中，有70%～80%是淺表性癌，多可經(jīng)手術(shù)切除或經(jīng)尿道電切術(shù)而治愈[3]。然而，20%～30%的復(fù)發(fā)患者伴有惡性程度增高或浸潤能力增強(qiáng)，且浸潤性膀胱癌的死亡人數(shù)是淺表性膀胱癌的2.459倍[4]。關(guān)于膀胱癌的發(fā)生機(jī)制目前尚不明確，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得對膀胱癌的認(rèn)識(shí)也逐步深入，膀胱癌診斷與治療的未來方向?qū)⑹窃趯ζ浞肿訖C(jī)制充分認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上進(jìn)行[5]。最新研究顯示，多種抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)5′CpG島的高甲基化可導(dǎo)致基因失活，從而使蛋白表達(dá)下調(diào)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，CDH1）基因是一種腫瘤抑制和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，于1995年首先克隆出來[7]。CDH1為鈣依賴性黏附蛋白家族中的重要成員，其表達(dá)于所有上皮細(xì)胞，在Ca2+的參與下介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附[8]。近年來大量臨床病理學(xué)研究證實(shí)，CDH1表達(dá)下調(diào)或缺失是眾多惡性腫瘤的普遍現(xiàn)象，如頭頸部腫瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌及前列腺癌等[9]。研究還發(fā)現(xiàn)，CDH1下調(diào)與缺失可導(dǎo)致有關(guān)的腫瘤抑制基因失活，如CDH1基因5′端啟動(dòng)子區(qū)甲基化與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切有關(guān)[10]，然而該結(jié)論尚存爭議。因此，本文將既往關(guān)于CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性的研究進(jìn)行Meta分析，以期為膀胱癌的臨床診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略參照Cochrane協(xié)作網(wǎng)制定的檢索策略在以下數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索：Cochrane Library（1993—2013年）、MEDLINE（1966—2013年）、EMBASE（1980—2013年）、Web of Science（1945—2013年）、EBSCO-CINAHL（1982—2013年）、萬方（1998—2013年）和CNKI（1915—2013年）。檢索詞：甲基化、methylation、突變、mutation、膀胱癌、bladder cancer、E-鈣黏蛋白、CDH1、E-cadherin等。采用主題詞結(jié)合自由詞原則進(jìn)行檢索，并手工檢索納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)以發(fā)現(xiàn)潛在符合納入標(biāo)準(zhǔn)的研究。

1.2 文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)（1）有關(guān)CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性的臨床對照研究或隊(duì)列研究。（2）所有患者均經(jīng)術(shù)前膀胱鏡檢查及術(shù)后病理檢查證實(shí)為膀胱癌。（3）納入文獻(xiàn)病例數(shù)不少于30例。（4）文獻(xiàn)的語種為中文或英文。（5）納入文獻(xiàn)應(yīng)提供完整的病例資料如甲基化頻率等數(shù)據(jù)，若同一作者采用相同資料進(jìn)行了多項(xiàng)研究并發(fā)表，則僅納入樣本量最大的或者最近發(fā)表的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取采用統(tǒng)一制定的數(shù)據(jù)收集表，由兩位研究者分別獨(dú)立提取數(shù)據(jù)，包括第一作者、文獻(xiàn)發(fā)表時(shí)間、國家、語種、研究設(shè)計(jì)、樣本量、種族、病理亞型、甲基化檢測方法、基因甲基化頻率等。數(shù)據(jù)提取過程中若出現(xiàn)爭議，通過與第三方討論解決分歧。

1.4 納入文獻(xiàn)質(zhì)量評價(jià)由2位研究者根據(jù)STREGA原則分別對納入文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)：（1）樣本量是否充分。（2）是否詳細(xì)介紹診斷標(biāo)準(zhǔn)。（3）分組匹配情況。（4）組間是否具有可比性，對照組基因型分布應(yīng)符合Hardy-Weinberg（H-W）遺傳平衡定律。（5）基因檢測方法是否合理。（6）數(shù)據(jù)是否充分。每滿足一項(xiàng)記為1分，總分≥3分者為高質(zhì)量文獻(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法Meta分析采用STATA 12.0軟件進(jìn)行。CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性關(guān)聯(lián)的強(qiáng)弱程度用優(yōu)勢比（odds ratios，OR）及其95%可信區(qū)間（95%CI）表示，并對OR值的顯著性進(jìn)行Z檢驗(yàn)。根據(jù)研究對象的種族、甲基化檢測方法的不同進(jìn)行亞組分析。使用以卡方檢驗(yàn)為基礎(chǔ)的Q檢驗(yàn)衡量樣本的同質(zhì)性，并以I2值的大小評價(jià)多個(gè)納入研究之間同質(zhì)性的程度（I2值愈大提示異質(zhì)性愈明顯）。各研究間異質(zhì)性采用Cochrane Q檢驗(yàn)進(jìn)行評價(jià)，若P＜0.10則提示存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型（DerSimonian Laird法）分析，反之則采用固定效應(yīng)模型（Mantel-Haenszel法）分析。采用Begger漏斗圖和Egger線性回歸分析納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚以評價(jià)原始分析結(jié)果的真實(shí)可靠性。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的基本信息最初檢索到相關(guān)文獻(xiàn)113篇，根據(jù)其題目和關(guān)鍵詞剔除45篇，進(jìn)一步閱讀摘要、全文及數(shù)據(jù)后剔除58篇，最終10項(xiàng)病例對照研究符合納入標(biāo)準(zhǔn)[11-20]，文獻(xiàn)篩選過程見圖1，發(fā)表時(shí)間2001年—2012年。本Meta分析共計(jì)762例研究對象，包括620例膀胱癌患者和142例健康對照人群。762例研究對象中共收集961例組織樣本進(jìn)行CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率檢測，包括620例膀胱癌組織，199例癌旁組織，142例正常膀胱上皮組織。納入研究中8項(xiàng)采用特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MSP）法檢測，另2項(xiàng)采用定量甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（Q-MSP）法檢測。納入文獻(xiàn)的基線特征和質(zhì)量評價(jià)見表1。

Fig.1Flow chart of literature search and study selection圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性10項(xiàng)研究之間存在明顯的異質(zhì)性（I2=81.5%，P＜0.001），因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型來分析CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織的CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化比例明顯高于癌旁及正常組織（OR=3.09，95%CI：1.13～8.50，P=0.029），見圖2。

Tab.1Baseline characteristics and methodological quality of all included studies表1 納入文獻(xiàn)基線特征與質(zhì)量評分

Fig.2The forest plot of CDH1 gene promoter methylation associated with bladder cancer susceptibility圖2 CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性關(guān)聯(lián)的森林圖

2.3 亞組分析研究對象種族亞組分析結(jié)果示：亞洲人群膀胱癌組織中CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率較高（OR=3.85，95%CI：1.46～10.14，P=0.006），而在歐美人群中沒有出現(xiàn)此結(jié)果（OR=2.22，95% CI：0.38～12.91，P=0.375），見圖3A。檢測方法亞組分析結(jié)果示：采用MSP方法檢測時(shí)，膀胱癌組織與癌旁及正常組織間CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率存在明顯差異，采用Q-MSP方法檢測時(shí)，兩組CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率無明顯差異，見圖3B。

2.4 異質(zhì)性與發(fā)表偏移評價(jià)本研究采用逐一刪除納入研究進(jìn)行敏感性分析以評價(jià)單一研究對總體結(jié)果的影響，結(jié)果表明無單一研究可顯著影響原始分析和亞組分析結(jié)果。Begger漏斗圖顯示圖形對稱提示無明確發(fā)表偏移，Egger線性回歸分析進(jìn)一步證實(shí)納入文獻(xiàn)無發(fā)表偏移（t=2.60,P=0.019）。

Fig.3Subgroup analysis of CDH1 gene promoter methylation associated with bladder cancer susceptibility圖3 CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性關(guān)聯(lián)亞組分析圖

3 討論

人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與DNA甲基化的異常修飾有關(guān)，而且早在腫瘤臨床確診之前就可檢測出特異基因的甲基化異?，F(xiàn)象。李才政等[21]研究亦表明CDH1表達(dá)異常在膀胱癌的惡性進(jìn)展中起重要作用，提示CDH1為一種侵襲抑制分子，可作為判斷膀胱癌惡性程度的指標(biāo)。

本Meta分析結(jié)果提示CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是導(dǎo)致CDH1蛋白表達(dá)降低的原因之一，由于本Meta分析存在研究間異質(zhì)性，故根據(jù)種族進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果表明CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與亞洲人群膀胱易感性密切相關(guān)，而與歐美人群無關(guān)。提示地域和種族因素是影響疾病易感性個(gè)體差異的重要原因，但造成這一差異的具體分子學(xué)機(jī)制尚不完全明確，可能與物種進(jìn)化及自然選擇有關(guān)[22]。根據(jù)檢測方法不同進(jìn)一步進(jìn)行亞組分析結(jié)果表明，當(dāng)納入研究采用MSP檢測方法時(shí)，膀胱癌組織與癌旁及正常組織間CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率存在明顯差異，但當(dāng)納入研究采用Q-MSP方法檢測時(shí)，兩組CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本次研究的結(jié)果和既往研究結(jié)果基本一致，證實(shí)了CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化是膀胱癌的危險(xiǎn)因素，它可能是膀胱癌早期診斷和預(yù)后判定的潛在生物標(biāo)志物。

與其他Meta分析一樣，本研究存在一定的不足與局限性。首先，納入文獻(xiàn)過少可能無法全面評價(jià)CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與膀胱癌易感性的真實(shí)關(guān)聯(lián)，并可能影響本Meta分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)效能。因此，仍需進(jìn)一步開展樣本量更大的臨床研究以提供更具代表性的統(tǒng)計(jì)分析。其次，作為一種回顧性研究，Meta分析可能存在回顧或選擇偏移，也可能會(huì)影響本研究結(jié)果的可信度。再者，由于無法獲取納入研究的原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)致無法評價(jià)其他指標(biāo)如臨床分期、年齡、性別等因素聯(lián)合CDH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化對膀胱癌易感性的影響。

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(2014-05-25收稿2014-07-25修回)

（本文編輯閆娟）

Role of E-cadherin gene promoter methylation in bladder carcinogenesis:a Meta-analysis

ZHANG Shuqing,ZHANG Xuliang,ZHANG Bo,HONG Liang
Department of Surgical Oncology,Huangshi Central Hospital,Huangshi 435000,China

ObjectiveTo assess the role of E-cadherin(CDH1)promoter methylation in bladder carcinogenesis by meta-analysis.MethodsThe relevant database were searched by the retrieval strategy of Cochrane network.All included studies were collected following data:the first author’s surname,publication year of article,country,language of publication, design of study,sample size,ethnicity,histological subtypes,methylation detection method and genotype frequencies etc. This meta-analysis was performed using the STATA 12.0 software.The crude odds ratio(OR)with 95%confidence interval (CI)was calculated.ResultsTen case-control studies were included in this meta-analysis.The methylation frequency of CDH1 was detected in 620 bladder cancer tissues and 341 normal or cancerous tissues.Results showed that the methylation frequency of CDH1 was significantly higher in bladder cancer tissue than that of normal or cancerous tissue(OR=3.09,95% CI:1.13～8.50,P=0.029).Furthermore,the ethnicity-stratified analysis revealed that the methylation frequency of CDH1 was significantly higher in bladder cancer tissue of Asian populations than that of normal or cancerous tissue(OR=3.85,95% CI:1.46～10.14,P=0.006),but no such association was found in Caucasian populations（OR=2.22,95%CI:0.38-12.91,P= 0.375).The subgroup analysis based on the detection methods revealed that there was a statistically significant difference in the methylation frequency of CDH1 between bladder cancer tissue and adjacent tissues and normal tissues under the MSP subgroup(P＜0.001),while such association was not observed under the Q-MSP subgroup(P=0.818).ConclusionPromoter methylation of CDH1 gene may be involved in the occurrence and development of bladder cancer,which may serve as a biomarker for diagnosis and prognosis of bladder cancer.

E-cadherin;methylation;bladder cancer;Meta-analysis

R737.14

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.026

湖北省黃石市中心醫(yī)院普愛病區(qū)腫瘤外科（郵編435000）

張書卿（1980），男，主治醫(yī)師，學(xué)士，主要從事胸腹部腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究