蔣姍姍，龍艷，蘇珂，聶寒，黃漓莉，楊帆，李爭(zhēng)明，荀靖瓊

青蒿琥酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-8表達(dá)的影響

蔣姍姍，龍艷△，蘇珂，聶寒，黃漓莉，楊帆，李爭(zhēng)明，荀靖瓊

目的探討青蒿琥酯（Art）對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的凋亡及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）表達(dá)的影響。方法傳代培養(yǎng)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，分為正常對(duì)照組、高糖組、高糖+不同濃度青蒿琥酯組（10、20、30 mg/L）、高糖+依那普利對(duì)照組（5 mg/L）。四甲基偶氮唑鹽微量比色（MTT）法觀察細(xì)胞增殖能力的改變；流式細(xì)胞儀AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-8蛋白含量。結(jié)果（1）經(jīng)高糖處理48 h后，NRK-52E細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8蛋白濃度升高。（2）經(jīng)青蒿琥酯干預(yù)后，與高糖組比較，NRK-52細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞凋亡率減低，細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8蛋白濃度降低，其干預(yù)作用呈現(xiàn)劑量依賴性。結(jié)論青蒿琥酯可抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞凋亡及細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-8的表達(dá)。青蒿琥酯的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用可能有助于糖尿病腎病的治療。

糖尿病腎??；細(xì)胞凋亡；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素8；青蒿琥酯；腎小管上皮細(xì)胞

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，目前已成為糖尿病患者的主要死亡原因之一。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腎內(nèi)炎癥反應(yīng)的激活為其主要病理損傷機(jī)制之一，炎癥因子及促炎癥細(xì)胞因子在DN的發(fā)展中起著重要作用，腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-8就是其中兩個(gè)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子[1]。青蒿琥酯（artesunate，Art）是從傳統(tǒng)中藥菊科植物黃花蒿中提取的倍半萜內(nèi)酯類化合物青蒿素的水溶性衍生物，為治療瘧疾的經(jīng)典藥物[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯還具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抗纖維化[5]、抗新生血管生成[6]等作用，已證實(shí)其可減輕腎間質(zhì)炎性損傷[7]，但目前國內(nèi)外尚鮮見其應(yīng)用于防治DN的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察青蒿琥酯對(duì)高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腎小管細(xì)胞凋亡的抑制作用，為其臨床應(yīng)用于DN的防治提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E）購于上海復(fù)祥生物科技有限公司（源于ATCC，貨號(hào)CRL-1571）。高糖、低糖DMEM培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品。噻唑蘭（MTT）粉末、二甲基亞砜（DMSO）、青鏈霉素混合液（×100）、胰蛋白酶消化液（0.25%）均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購于北京嘉美紐諾生物科技有限公司。IL-8 ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；TNF-α ELISA試劑盒購于欣博盛生物科技有限公司。注射用青蒿琥酯（批號(hào)LA130613,規(guī)格60 mg/支）由桂林南藥股份有限公司生產(chǎn)，用1 mL 5%NaHCO3注射液助溶，配成60 g/L濃度的儲(chǔ)存液保存于4℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無血清培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液。馬來酸依那普利（Ena）原料藥由武漢勝天宇生物科技有限公司生產(chǎn)，用PBS溶液（pH 7.4）配成1 mmol/L儲(chǔ)存液，過濾除菌后保存于4℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)用無血清培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖濃度5.6 mmol/L）于37℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞呈單層貼壁鋪路石樣生長(zhǎng)，長(zhǎng)至80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。取第5～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理細(xì)胞穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)時(shí)加入無血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索的藥物濃度，將NRK-52E細(xì)胞隨機(jī)分為6組。（1）正常對(duì)照組（A組）：低糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖終濃度為5.6 mmol/L）；（2）高糖組（B組）：高糖DMEM培養(yǎng)基（D-葡萄糖終濃度25 mmol/L）；（3）高糖+青蒿琥酯小劑量組（C組）：高糖DMEM培養(yǎng)基+青蒿琥酯（終濃度10 mg/L）；（4）高糖+青蒿琥酯中劑量組（D組）：高糖DMEM培養(yǎng)基+青蒿琥酯（終濃度為20 mg/L）；（5）高糖+青蒿琥酯大劑量組（E組）：高糖DMEM培養(yǎng)基+青蒿琥酯（終濃度30 mg/L）；（6）高糖+依那普利陽性藥物對(duì)照組（F組）：高糖DMEM培養(yǎng)基+依那普利（終濃度5 mg/L）。

1.4 四甲基偶氮唑鹽微量比色（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況MTT粉劑用高壓滅菌處理的PBS溶液（pH7.4）配成濃度為5 g/L的儲(chǔ)存液，過濾除菌，4℃保存。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL培養(yǎng)基。細(xì)胞貼壁后，用無血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，細(xì)胞進(jìn)入靜止期后吸棄孔中的培養(yǎng)基，按以上實(shí)驗(yàn)分組每孔加入180 μL相應(yīng)的含藥物培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置調(diào)零孔。將96孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，等藥物作用48 h后，避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上避光低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的光密度值（OD490）。根據(jù)OD值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目，了解細(xì)胞的增殖能力。

1.5 AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率待細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換無血清低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細(xì)胞周期同步化，再按上述分組加藥處理48 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液中懸浮細(xì)胞和用胰酶消化的細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min。用PBS洗滌細(xì)胞1次，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。用400 μL緩沖液重懸細(xì)胞后，加入5 μL AnnexinV-FIFC，混勻后室溫避光孵育15 min。再加入10 μL PI染色液，混勻后冰浴避光放置5 min。篩網(wǎng)過濾后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，計(jì)算各組細(xì)胞AnnexinV-FIFC和PI染色細(xì)胞百分含量。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)TNF-α及IL-8水平細(xì)胞經(jīng)上述分組加藥處理培養(yǎng)48 h后收集各組上清液，同一標(biāo)本設(shè)立復(fù)管。按ELISA試劑盒說明書操作，在操作前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以建立最佳稀釋倍數(shù)。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm處測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)量值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)本中TNF-α、IL-8的相應(yīng)濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，多個(gè)樣本之間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖和青蒿琥酯對(duì)NRK-52E細(xì)胞增殖能力的影響MTT結(jié)果顯示，與低糖組（A組）比較，高糖組（B組）培養(yǎng)48 h后細(xì)胞OD490明顯減低，提示高糖可抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖。與B組比較，藥物干預(yù)（C、D、E、F）組細(xì)胞OD490明顯升高，但仍低于A組，提示用不同濃度青蒿琥酯和依那普利干預(yù)后細(xì)胞增殖能力較高糖組明顯升高，且青蒿琥酯濃度越高，細(xì)胞增殖能力升高越明顯（均P＜0.05）。青蒿琥酯中劑量組（D組）與依那普利組（F組）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但青蒿琥酯小、大劑量組（C、E組）與依那普利組（F組）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 高糖和青蒿琥酯對(duì)NRK-52E細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，各組加藥處理48 h后，與A組比較，B組細(xì)胞凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）明顯增高，提示高糖可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞凋亡；與B組比較，C、D、E、F組細(xì)胞凋亡率均降低，但仍高于A組，提示用不同濃度青蒿琥酯和依那普利干預(yù)后均可抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞的凋亡，且D組和E組較C組抑制凋亡效應(yīng)更加顯著（均P＜0.05）。C組與F組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但D、E組均低于F組（P＜0.05），見圖1、表1。

Tab.1The cell proliferations and apoptotic rates of in different groups of NRK-52E cells表1 各組NRK-52E細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡情況（n=6，）

Tab.1The cell proliferations and apoptotic rates of in different groups of NRK-52E cells表1 各組NRK-52E細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及凋亡情況（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與A組比較，b與B組比較，c與C組比較，d與D組比較，e與E組比較，P＜0.05；表2同

OD490值0.602±0.032 0.358±0.018a 0.431±0.020ab 0.488±0.029abc 0.542±0.038abcd 0.486±0.032abce 51.308＊＊組別A組B組C組D組E組F組F細(xì)胞凋亡率（%）10.80±0.98 42.62±1.32a 19.85±0.41ab 17.25±0.36abc 16.08±0.56abc 19.10±0.37abde 1 282.381＊＊

2.3 高糖和青蒿琥酯對(duì)NRK-52E細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8水平的影響ELISA結(jié)果顯示，各組培養(yǎng)48 h后，A組上清中TNF-α、IL-8呈較低水平，B組水平明顯升高；而C、D、E、F組水平明顯低于B組，但仍高于A組（P＜0.05）。提示用不同濃度青蒿琥酯和依那普利干預(yù)后均可抑制高糖誘導(dǎo)的NRK-52E炎癥因子TNF-α、IL-8的分泌，且青蒿琥酯濃度越高，抑制作用越明顯。C、D、E組與F組TNF-α水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C、D組與F組IL-8水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），E組IL-8水平低于F組（P＜0.05），見表2。

Tab.2Expressions of TNF-α and IL-8 in different NRK-52E supernatant groups表2 各組NRK-52E上清液中TNF-α、IL-8表達(dá)水平（n=6，mg/L，）

Tab.2Expressions of TNF-α and IL-8 in different NRK-52E supernatant groups表2 各組NRK-52E上清液中TNF-α、IL-8表達(dá)水平（n=6，mg/L，）

TNF-α 31.41±0.93 49.76±0.45a 43.66±0.29ab 37.26±0.52abc 34.17±0.33abcd 39.52±0.69abcde 760.198＊＊組別A組B組C組D組E組F組F IL-8 11.39±0.55 15.29±0.52a 14.23±0.32ab 13.40±0.31abc 12.43±0.26abcd 13.80±0.29abe 73.454＊＊

3 討論

目前DN在臨床治療上尚無有效方法，主要以對(duì)癥支持治療延緩腎功能的損害為主。長(zhǎng)時(shí)間的藥物治療，不僅影響患者的生活質(zhì)量，其治療費(fèi)用也給患者及社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此如何在DN早期進(jìn)行防治干預(yù)仍是當(dāng)前及未來研究的熱點(diǎn)。以往認(rèn)為DN早期階段主要是腎小球病變，但近年研究發(fā)現(xiàn)，在DN早期腎小管的損害可能早于腎小球的損害，因?yàn)榕R床中在尚無尿微量白蛋白時(shí)尿中已有多種腎小管蛋白存在[8]。因此近年來研究者越來越重視腎小管上皮細(xì)胞損傷和凋亡在DN發(fā)病機(jī)制中的作用。

3.1 高糖誘導(dǎo)與腎小管細(xì)胞的凋亡研究表明，高糖環(huán)境可通過多種途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，如Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）途徑[9]、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regular protein kinase，ERK）途徑[10]、c-Jun氨基末端激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）途徑[11]、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases,p38MARK）[12]途徑等，導(dǎo)致腎小管再吸收和分泌功能異常，促進(jìn)腎臟小管間質(zhì)纖維化改變，是DN進(jìn)展為終末期腎?。‥nd stage renal disease，ESRD）的重要因素。因此，腎小管上皮細(xì)胞凋亡在糖尿病腎損傷中具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，高糖培養(yǎng)可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。

Fig.1The apoptotic rates in different groups of NRK-52E cells圖1 各組NRK-52E細(xì)胞凋亡情況

3.2 高糖誘導(dǎo)與腎小管細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子表達(dá)炎癥反應(yīng)是DN持續(xù)發(fā)展的重要因素，炎癥反應(yīng)越強(qiáng)烈，腎臟損傷越嚴(yán)重。本研究表明，高糖刺激下NRK-52E細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8濃度明顯高于低糖組，說明高糖可激活腎小管上皮細(xì)胞分泌炎性分子。TNF-α和IL-8是2個(gè)在炎癥反應(yīng)中釋放較早的內(nèi)源性介質(zhì)，在細(xì)胞分化和凋亡等過程中起著重要作用[1]。TNF-α可由腎小球系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞以及浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)IL-1、IL-6、白三烯、前列腺素和血小板活化因子等炎癥介質(zhì)的合成，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)展[13]。IL-8主要由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可使中性粒細(xì)胞趨化、脫顆粒并釋放溶酶，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。炎癥刺激腎小管上皮細(xì)胞分泌釋放更多的免疫介質(zhì)和細(xì)胞因子，使腎間質(zhì)單核-巨噬細(xì)胞聚集，經(jīng)上皮間葉轉(zhuǎn)化來的肌纖維細(xì)胞和原基質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致間質(zhì)纖維化，促使腎病進(jìn)入終末期[14]。同時(shí)，炎癥反應(yīng)并不是孤立的，它與其他機(jī)制如氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）過度激活、血流動(dòng)力學(xué)改變等一起加快了腎病的進(jìn)展[15]。因此目前治療DN的藥物很多都是通過抗炎治療的，如他汀類、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）類、醛固酮拮抗劑及麥考酚酸莫酯等。

3.3 青蒿琥酯對(duì)高糖誘導(dǎo)下腎小管細(xì)胞的影響青蒿琥酯作為經(jīng)典抗瘧疾中藥，近年來研究顯示其還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。眾所周知，ACEI是目前在DN治療中應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)的藥物，有很好的腎臟保護(hù)作用，其可通過多種機(jī)制，抑制DN炎癥反應(yīng)，故該研究采用依那普利作為陽性對(duì)照藥物。本研究顯示，高糖誘導(dǎo)后腎小管細(xì)胞凋亡率及培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-8濃度均升高，經(jīng)青蒿琥酯及依那普利干預(yù)后細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-8濃度均出現(xiàn)不同程度的抑制；且青蒿琥酯大、中劑量的抑制程度強(qiáng)于小劑量濃度，呈現(xiàn)出劑量依賴性。由于本實(shí)驗(yàn)只觀察了各組細(xì)胞加藥誘導(dǎo)后48 h的變化，是否存在時(shí)間依賴性仍需進(jìn)一步觀察。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯小劑量對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率升高及青蒿琥酯小、中劑量對(duì)高糖誘導(dǎo)后細(xì)胞上清液中IL-8濃度升高所呈現(xiàn)出的抑制程度與依那普利比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明青蒿琥酯在減少炎性因子的釋放和抑制細(xì)胞凋亡方面可與ACEI類藥物依那普利達(dá)到同樣的效果。由此推測(cè)，青蒿琥酯可能是通過抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減少某些炎性因子的釋放，阻斷高糖的促凋亡作用，從而減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而防止腎損害的發(fā)生。

綜上所述，青蒿琥酯可以抑制高糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腎小管細(xì)胞凋亡，提示腎小管上皮細(xì)胞是青蒿琥酯的抗炎作用靶點(diǎn)，也為防治DN提供了新的思路。青蒿琥酯極可能成為防治DN的新藥物，但作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。另外，體外實(shí)驗(yàn)不能完全模擬復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，因此青蒿琥酯對(duì)DN的腎臟保護(hù)作用還有待于大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證實(shí)。

[1]Navarro-González JF,Mora-Fernández C,Muros de Fuentes M,et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Nat Rev Nephrol,2011,7(6):327-340.doi: 10.1038/nrneph.2011.51.

[2]Nzila A,Al-Zahrani I.Drugs for the treatment of malaria in the Kingdom of Saudi Arabia[J].Saudi Med J,2013,34(6):569-578.

[3]Mo HY,Wang LF,Zhang LH.Effects of artesunate on tumor necrosis factor α and chemotactic factors in the serum and the synoviocyte culture supernate of collagen-induced arthritis rats[J].Chin J Integr Tradit West Med,2012,32(2):253-256.[莫漢有，王麗芳，張麗華.青蒿琥酯對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α及趨化因子的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2012,32(2):253-256].

[4]Liu L,Zuo LF，Wang J.Effects of artesunate on membrane potential of mitochondria and cell apoptosis of Ec9706 cells[J].Med J Chin PLA, 2014,39(1):25-29.[劉亮，左連富，王靜.青蒿琥酯對(duì)食管癌Ec9706細(xì)胞線粒體膜電位及凋亡的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2014,39(1): 25-29].doi：10.11855/j.issn.0577-7402.2014.01.06.

[5]Wang CM,Chen J,Jiang M,et al.Relationship between artesunate influence on the process of TGF-β1 induced alveolar epithelial cells transform into mesenchymal cells and on idiopathic pulmonary fibrosis[J].Acta Pharm Sin,2014,49(1):142-147.[王昌明，陳娟，蔣明，等.青蒿琥酯干預(yù)TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與肺纖維化的關(guān)系[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2014,49(1):142-147].

[6]Liu Y,Peng HC,Tang H.Effects of artesunate on proliferation and expression of VEGF in human retinal capillary endothelial cells treated with high glucose[J].Int Eye Sci,2013,13(2):252-255.[劉逸，彭輝燦，唐虹.青蒿琥酯對(duì)高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)的影響[J].國際眼科雜志,2013,13(2): 252-255].doi:10.3980/j.issn.1672-5123.2013.02.08.

[7]Ma XY,Wu WH,Zeng Y,et al.The anti-inflammatory effect and its mechanism of Artemisia on the renal of UUO rats[J].Chongqing Med, 2010,39(12):1514-1516.[馬行一，吳蔚樺，曾燕，等.青蒿琥酯對(duì)UUO模型大鼠腎臟的抗炎作用及其機(jī)制研究[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39(12): 1514-151].doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2010.12.013.

[8]Abdel Aziz MT,Wassef MA,Ahmed HH,et al.The role of bone marrow derived-mesenchymal stem cells in attenuation of kidney function in rats with diabetic nephropathy[J].Diabetol Metab Syndr, 2014,6(1):34.doi:10.1186/1758-5996-6-34.

[9]Allam R,Scherbaum CR,Darisipudi MN,et al.Histones from dying renal cells aggravate kidney injury via TLR2 and TLR4[J].J Am Soc Nephrol,2012,23(8):1375-1388.doi:10.1681/ASN.2011111077.

[10]Mohamed R,Jayakumar C,Ranganathan PV,et al.Kidney proximal tubular epithelial-specific overexpression of netrin-1 suppresses inflammation and albuminuria through suppression of COX-2-mediated PGE2 production in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Am J Pathol,2012,181(6):1991-2002.doi:10.1016/j.ajpath.2012.08.014.

[11]Benedetti G,Fredriksson L,Herpers B,et al.TNF-α-mediated NF-κB survival signaling impairment by cisplatin enhances JNK activation allowing synergistic apoptosis of renal proximal tubular cells[J].BiochemPharmacol,2013,85(2):274-286.doi:10.1016/j. bcp.2012.10.012.

[12]Gong X,Wang Q,Tang X,et al.Tetramethylpyrazine prevents contrast-induced nephropathy by inhibiting p38 MAPK and FoxO1 signaling pathways[J].Am J Nephrol,2013,37(3):199-207.doi: 10.1159/000347033.

[13]Fernández-Real JM,Vendrell J,García I,et al.Structural damage in diabetic nephropathy is associated with TNF-α system activity [J].Acta Diabetol,2012,49(4):301-305.doi:10.1007/s00592-011-0349-y.

[14]Lima SM,Grisi DC,Kogawa EM,et al.Diabetes mellitus and inflammatory pulpal and periapical disease:a review[J].Int Endod J, 2013,46(8):700-709.doi:10.1111/iej.12072.

[15]Yang SM,Ka SM,Wu HL,et al.Thrombomodulin domain 1 ameliorates diabetic nephropathy in mice via anti-NF-κB/NLRP3 inflammasome-mediated inflammation,enhancement of NRF2 antioxidant activity and inhibition of apoptosis[J].Diabetologia,2014,57(2): 424-434.doi:10.1007/s00125-013-3115-6.

（2014-05-26收稿2014-08-29修回）

（本文編輯李鵬）

Effects of artesunate on high glucose-induced cell apoptosis,TNF-α and IL-8 expression in renal tubular epithelial cells

JIANG Shanshan,LONG Yan△，SU Ke,NIE Han,HUANG Lili,YANG Fan,LI Zhengming,XUN Jingqiong
Department of Endocrinology,Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guangxi 541004,China△

ObjectiveTo investigate the effects of artesunate(Art)on cell apoptosis,tumor necrosis factor-alpha(TNF-α)and interleukin-8(IL-8)expression induced by high glucose in rat renal tubular epithelial cells(NRK-52E).Methods NRK-52E cells were cultured and divided into normal control group,high glucose group,high glucose with different concentrations of Art(10 mg/L,20 mg/L and 30 mg/L)groups,and high glucose with Ena(5 mg/L)group.MTT assay was used to detect the cell proliferation.The apoptotic rate was evaluated by flow cytometry with AnnexinV-FITC/PI double stains.The protein levels of TNF-α and IL-8 in the cell culture supernatant were determined using ELISA.ResultsHigh glucose inhibited NRK-52E proliferation,induced its apoptosis,and the expressions of TNF-α and IL-8 in the supernatant.Application of Art obviously abolished the effects of high glucose,and the effects of Art were showed in dose-dependent manner.ConclusionArt can suppress high glucose-stimulated cell apoptosis,enhance TNF-α and IL-8 expression in NRK-52E cells. The anti-inflammatory action and immune regulation of Art could be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

diabetic nephropathies；apoptosis；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-8；artesunate；renal tubular epithelial cells

R587.24

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2015.01.006

廣西醫(yī)療衛(wèi)生適宜技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目（S201316-07）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012GXNSFAA053085）；廣西高等學(xué)校計(jì)劃科研項(xiàng)目（201204LX246）

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（郵編541004）

蔣珊珊（1986），女，碩士在讀，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥研究

△通訊作者E-mail：ly136988@163.com