張羽飛，李厚忠，王學(xué)勇，馬洪闖，武 艷，袁曉環(huán)，初彥輝

1牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江1570112牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥理教研室，黑龍江牡丹江1570113中國人民解放軍第209醫(yī)院燒傷外科，黑龍江牡丹江157011

增生性瘢痕形態(tài)學(xué)觀察及血管內(nèi)皮生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶1表達(dá)的檢測與意義

張羽飛1，李厚忠2，王學(xué)勇3，馬洪闖1，武 艷1，袁曉環(huán)1，初彥輝1

1牡丹江醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，黑龍江牡丹江157011
2牡丹江醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院藥理教研室，黑龍江牡丹江157011
3中國人民解放軍第209醫(yī)院燒傷外科，黑龍江牡丹江157011

目的 研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶1(TAK1)在正常皮膚及增生性瘢痕組織中的表達(dá)，并結(jié)合增生性瘢痕的形態(tài)學(xué)觀察，探討其在病理性瘢痕發(fā)病機(jī)制中的作用，為病理性瘢痕的臨床治療提供一定的依據(jù)與參考。方法 采用常規(guī)HE、Masson染色、免疫熒光方法和熒光定量PCR法對10例來自體正常皮膚及15例增生性瘢痕進(jìn)行VEGF和TAK1在組織中的定位與表達(dá)量的檢測、病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果 形態(tài)學(xué)觀察顯示增生性瘢痕的表皮形態(tài)異常，增生性瘢痕組織中的真皮成纖維細(xì)胞較正常皮膚排列紊亂、致密。免疫熒光結(jié)果顯示增生性瘢痕組織中VEGF和TAK1的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常皮膚組織。熒光定量PCR結(jié)果顯示VEGF和TAK1在增生性瘢痕組織中表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0．01，P＜0．05)。結(jié)論 增生性瘢痕組織膠原纖維化程度明顯高于正常皮膚組織，且瘢痕組織中VEGF與TAK1表達(dá)程度均高于正常組織，對增生性瘢痕的形成可能發(fā)揮促進(jìn)作用。VEGF與TAK1可作為增生性瘢痕診斷與鑒別診斷的參考指標(biāo)，為防治病理性瘢痕形成提供新的治療靶點。

增生性瘢痕;膠原纖維化;血管內(nèi)皮生長因子;轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶1

Acta Acad Med Sin，2015，37(4):446-450

近年來，內(nèi)源性生長因子與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成的關(guān)系愈來愈受到人們的關(guān)注。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的促血管生成細(xì)胞生長因子，在血管形成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合與組織修復(fù)、促進(jìn)組織再生方面發(fā)揮重要的作用［1］。轉(zhuǎn)化生長因子 β激活性激酶1(transforming growth factor-beta-activated kinase 1，TAK1)，又名有絲分裂原激活蛋白激酶激酶激酶7，屬于絲裂原活化蛋白激酶中的一種，目前認(rèn)為TAK1蛋白主要通過絲裂原活化蛋白激酶三級級聯(lián)信號通路，參與炎癥反應(yīng)、纖維化和腫瘤等［2-3］。TAK1在瘢痕組織中的異常表達(dá)，在國外已有報道，但為數(shù)尚少，TAK1與增生性瘢痕形成的關(guān)系在國內(nèi)卻罕見報道。為此，本研究以增生性瘢痕以及自體正常皮膚作為研究對象，采用免疫熒光方法和熒光定量PCR法檢測VEGF和TAK1在增生性瘢痕及正常皮膚組織中的表達(dá)水平和分布特點，探討其表達(dá)與病理性瘢痕形成之間的關(guān)系。同時，結(jié)合常規(guī)染色方法光鏡下觀察增生性瘢痕的形態(tài)學(xué)變化，初步探討VEGF和TAK1在增生性瘢痕組織中表達(dá)的意義，為增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制的研究和防治提供新的思路和方法，從而為病理性瘢痕的臨床治療提供一定的依據(jù)與參考。

材料和方法

材料 本研究標(biāo)本收集于在解放軍第209醫(yī)院實施手術(shù)切除的15例增生性瘢痕組織標(biāo)本作為研究對象，同時收集瘢痕切除術(shù)患者對應(yīng)的邊緣正常組織作為對照，共10例。臨床診斷均為增生性瘢痕患者，為一年生瘢痕，其中男性8例、女性7例。增生性瘢痕主要位于面頸部2例、軀干5例、上肢3例、下肢5例。增生性瘢痕病因主要有燒傷5例、熱液燙傷2例、化學(xué)燒傷3例、機(jī)械性創(chuàng)傷3例、其他2例。每份標(biāo)本均分為兩部分，分別用于形態(tài)學(xué)觀察和分子水平檢測。臨床收集標(biāo)本，一份標(biāo)本及時固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片。另一份組織保存于-80℃。所有患者均無器質(zhì)性疾病，亦未經(jīng)任何特殊治療。手術(shù)中所取標(biāo)本均取得患者或家屬知情同意。Masson染色試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，SYBR Green Master購于Roche公司，Trizol購于Invitrogen公司，小鼠多克隆抗VEGF抗體、兔多克隆抗TAK1抗體、二抗購于abcam公司，牛血清白蛋白、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚購于Sigma公司，Taq酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司，NanoDrop分光光度計購于Thermo公司，實時定量PCR擴(kuò)增儀購于BioRad公司，激光共聚焦顯微鏡購于Olympus公司。

HE染色 分別取正常皮膚、增生性瘢痕組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片，厚5 μm，HE染色，光鏡下對比觀察，拍照。

Masson染色 分別取正常皮膚、增生性瘢痕組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片，Masson染色。光鏡下觀察心肌細(xì)胞呈紅色或黃色，纖維組織呈藍(lán)色，光鏡下對比觀察，拍照。

免疫熒光檢測 分別取正常皮膚、增生性瘢痕組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚8 μm)，冷風(fēng)干燥后，室溫下1%BSA封閉1 h，PBS充分洗滌(5 min×3)，滴加抗VEGF/抗TAK1工作濃度為 1∶150，4℃孵育過夜，PBS充分洗滌(5 min×3)，滴加工作濃度為l∶200異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗，孵育1 h，PBS充分洗滌(5 min×3)，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，室溫放置15 min，PBS充分洗滌(5 min×2)，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。綠色(TAK1)/紅色(VEGF)熒光為陽性表達(dá)。

熒光定量PCR檢測瘢痕和正常組織中VEGF和TAK1 mRNA的表達(dá) 將100 mg組織加入1 ml TRIzol置勻漿器中，氯仿-異丙醇法提取總RNA。經(jīng)NanoDrop分光光度計定量后，取1 μg RNA，20 μl逆轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA，然后用SYBR Green Master行實時定量PCR反應(yīng):即在20 μl PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計:(1)內(nèi)參GADPH:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(上游)，5’-AAGATGGTGATGGGATTTC-3’(下游)，擴(kuò)增片段225 bp;(2)VEGF:5’-CGAGACCCTGGTGGACATCTT-3’(上游)，5’-TGGCCTTGGTGAGGTTTGATC-3’(下游)，擴(kuò)增片段180 bp;(3)TAK1: 5’-CATTTGGCAACATTCTGG-3’(上游)，5’-CATTCTGACACTGGGACT-3’(下游)，擴(kuò)增片段143 bp。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，40個循環(huán)，72℃終延伸10 min。每份標(biāo)本進(jìn)行2個復(fù)管檢測。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad prism 5．0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示，兩組計量資料數(shù)據(jù)比較用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

HE染色結(jié)果 與正常皮膚組織相比，增生性瘢痕真皮乳突消失，無表皮皮突與真皮乳突相互交錯現(xiàn)象，而正常皮膚的表皮皮突與真皮乳突相互交錯，形態(tài)規(guī)則。此外，增生性瘢痕鏡下可見為數(shù)眾多的成纖維細(xì)胞與大量的膠原纖維，粗細(xì)不一，排列紊亂、致密，而正常對照組織中膠原纖維排列疏松、規(guī)則(圖1)。

Masson染色結(jié)果 增生性瘢痕組織中膠原纖維表達(dá)明顯高于正常組織，且呈條束狀，排列紊亂，密度分布不均，呈渦輪狀或結(jié)節(jié)狀等不規(guī)則排列現(xiàn)象(圖2)。

免疫熒光檢測結(jié)果 VEGF表達(dá)呈紅色熒光，免疫熒光檢測顯示在增生性瘢痕組織下表皮光斑大量表達(dá)，而正常皮膚組織真皮層的光斑較少(圖3)。 TAK1表達(dá)呈綠色熒光，免疫熒光檢測顯示正常皮膚組織中真皮層中TAK1表達(dá)較少，而增生性瘢痕組織中TAK1大量表達(dá)(圖4)。

圖1 正常皮膚(A)和增生性瘢痕(B)組織形態(tài)學(xué)觀察(HE染色，×100)Fig 1 Morphological observation of normal skin(A)and hypertrophic scar(B)(HE staining，×100)

圖2 正常皮膚(A)和增生性瘢痕(B)組織形態(tài)學(xué)觀察(Masson染色，×100)Fig 2 Morphological observation of normal skin(A)and hypertrophic scar(B)(Masson staining，×100)

圖3 VEGF在正常組織和增生性瘢痕組織的表達(dá)(免疫熒光，×100)Fig 3 VEGF expressions in normal skin and hypertrophic scar(immunofluorescence staining，×100)

VEGF和TAK1 mRNA水平的表達(dá) 熒光定量PCR檢測顯示增生性瘢痕組織內(nèi)VEGF和TAK1 mRNA表達(dá)水平均較正常組織明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01，P＜0．05)(圖5)。

圖4 TAK1在正常組織和增生性瘢痕組織的表達(dá)(免疫熒光，×200)Fig 4 TAK1 expression in normal skin and hypertrophic scar(immunofluorescence staining，×200)

圖5 正常組織和增生性瘢痕組織中VEGF(A)和TAK1(B)mRNA的表達(dá)Fig 5 Expressions of VEGF(A)and TAK1(B)mRNA in normal skin and hypertrophic scar

討論

創(chuàng)面的愈合以及正常組織損傷修復(fù)過程中形成瘢痕組織，是正常的生理表現(xiàn)。當(dāng)皮膚受到創(chuàng)傷后，通過肉芽組織改建成熟后變?yōu)槔匣A段的纖維結(jié)締組織修復(fù)創(chuàng)面，即形成瘢痕組織［4］。而皮膚出現(xiàn)嚴(yán)重創(chuàng)傷或伴有感染時，在修復(fù)的過程中可能會出現(xiàn)過度修復(fù)或異常修復(fù)的結(jié)果，最終形成病理性瘢痕(包括增生性瘢痕、瘢痕疙瘩)。病理性瘢痕往往會造成關(guān)節(jié)、局部器官的正常功能障礙，給患者造成巨大的痛苦。目前治療瘢痕的方法有許多，但均不能從根本上達(dá)到防治病理性瘢痕的目的。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此盡早發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕的病理機(jī)制成為當(dāng)下科研工作者的一個重要課題，隨著基因療法的研究深入，人們逐漸將治療瘢痕的目光投入到與瘢痕形成有關(guān)的相應(yīng)的基因中［5］。

隨著對增生性瘢痕發(fā)生機(jī)制研究的深入，內(nèi)源性生長因子與瘢痕發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系愈來愈受到重視［6］。有研究證實VEGF是新生血管形成中最重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子之一，具有強(qiáng)烈的促血管生成作用，人們發(fā)現(xiàn)新血管形成在瘢痕增生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1，7-8］。本研究通過免疫熒光法顯示，VEGF在增生性瘢痕真皮層的分布與表達(dá)明顯高于正常皮膚中的表達(dá)量，熒光定量PCR結(jié)果顯示VEGF mRNA表達(dá)水平也較正常組織增高(P＜0．01)，表明增生性瘢痕組織中有新生血管形成，新生血管的形成為增生性瘢痕的增生提供了營養(yǎng)基礎(chǔ)，在增生性瘢痕的形成、發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用。這與文獻(xiàn)［9］報道結(jié)果一致。因此，在臨床上如能針對新生血管形成施加因素，理論上講，能對瘢痕組織的過度增生有一定的防治作用［10］。

TAK1是固有免疫和適應(yīng)性免疫信號通路中的重要調(diào)節(jié)蛋白，在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和腫瘤壞死因子α等因素刺激下，TAK1被活化，能夠啟動下游一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，主要參與細(xì)胞凋亡、周期調(diào)控、細(xì)胞分化、纖維化疾病等重要生理病理過程［3，11］。研究顯示TAK1具有抑制小鼠的小腸上皮細(xì)胞、皮膚角化細(xì)胞、肝細(xì)胞等細(xì)胞凋亡的作用［12-14］。TAK1的異常表達(dá)已經(jīng)在其他真皮纖維化疾病和多種腫瘤疾病中發(fā)現(xiàn)，在纖維化疾病(如系統(tǒng)性硬皮病)中TAK1表達(dá)增強(qiáng)［15］，另有報道顯示在皮膚傷口部位注射TAK1可明顯促進(jìn)傷口愈合，而且TAK1缺陷小鼠表現(xiàn)為皮膚厚度和膠原沉積逐步減少［16-17］。本研究顯示TAK1在增生性瘢痕組織中的表達(dá)明顯增多，免疫熒光和熒光定量PCR結(jié)果顯示的趨勢一致，提示TAK1處于活化狀態(tài)，表明其在瘢痕發(fā)生和演變過程中具有重要作用。TAK1與增生性瘢痕形成的關(guān)系在國內(nèi)報道較少，其較深入的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步探討。

在增生性瘢痕纖維化形成過程中，有多種因素參與，其中TGF-β1發(fā)揮關(guān)鍵作用，TAK1為TGF-β1下游因子，可以被TGF-β1激活，主要直接地通過促進(jìn)瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞增殖以及合成膠原纖維，參與瘢痕增生與形成。而VEGF通過促進(jìn)瘢痕內(nèi)部大量的血管增生，為瘢痕增生提供充分的氧氣、營養(yǎng)供應(yīng)，間接地促進(jìn)瘢痕膠原合成，兩細(xì)胞因子均能明顯地促進(jìn)瘢痕增生與形成。

綜上，本研究為進(jìn)一步深入探索生長因子在瘢痕發(fā)生過程中調(diào)控作用及臨床瘢痕防治手段的建立提供了實驗依據(jù)。而TAK1與其他生長因子在瘢痕發(fā)生和發(fā)展過程中的相互關(guān)系尚不清楚，值得進(jìn)一步探討。

［1］Wilgus TA，F(xiàn)erreira AM，Oberyszyn TM，et al．Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor［J］．Lab Invest，2008，88(6):579-590．

［2］Delaney JR，Mlodzik M．TGF-beta activated kinase-1:new insights into the diverse roles of TAK1 in development and immunity［J］．Cell Cycle，2006，5(24):2852-2855．

［3］Sakurai H．Targeting of TAK1 in inflammatory disorders and cancer［J］．Trends Pharmacol Sci，2012，33(10):522-530．

［4］Pitzer GB，Patel KG．Proper care of early wounds to optimize healing and prevent complication［J］．Facial Plast Surg Clin North Am，2011，19(3):491-504．

［5］Wolfram D，Tzankov A，Pülzl P，et al．Hypertrophic scars and keloids-a review of their pathophysiology，risk factors，and therapeutic management［J］．Dermatol Surg，2009，35(2):171-181．

［6］Matthew RJ，Gautam GS，Joseph PA，et al．Novel therapies for scar reduction and regenerative healing of skin wounds ［J］．Trends Biotechnol，2008，4(26):173-180．

［7］Johnson KE，Wilgus TA．Vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the regulation of cutaneous wound repair ［J］．Adv Wound Care(New Rochelle)，2014，3(10): 647-661．

［8］Qing C，Wang ZY，Song F，et al．Dynamic biological changes in fibroblasts during hypertrophic scar formation and regression ［J］．Int Wound J，2014［Epub ahead of print］．

［9］Keswani SG，Balaji S，Le LD，et al．Role of salivary vascular endothelial growth factor(VEGF)in palatal mucosal wound healing［J］．Wound Repair Regen，2013，21(4):554-562．

［10］Wietecha MS，DiPietro LA．Therapeutic approaches to the regulation of wound angiogenesis［J］．Adv Wound Care(New Rochelle)，2013，2(3):81-86．

［11］Schuman J，Chen Y，Podd A，et al．A critical role of TAK1 in B-cell receptor-mediated nuclear factor kappa B activation ［J］．Blood，2009，113(19):4566-4574．

［12］Kajino Sakamoto R，Inagaki M，Lippert E，et al．Enterocytederived TAK1 signaling prevents epithelium apoptosis and the development of ileitis and colitis［J］．J Immunol，2008，181(2):1143-1152．

［13］Omori E，Matsumoto K，Sanjo H，et al．TAK1 is a master regulator of epidermal homeostasis involving skin inflammation and apoptosis［J］．J Biol Chem，2006，281(28):19610-19617．

［14］Inokuchi S，Aoyama T，Miura K．Disruption of TAK1 in hepatocytes causes hepatic injury，inflammation，fibrosis，and carcinogenesis［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(2):844-849．

［15］Xu SW，Parapuram SK，Pala D，et al．Requirement of transforming growth factor beta-activated kinase 1 for transforming growth factor beta-induced alpha-smooth muscle actin expression and extracellularmatrixcontraction in fibroblasts［J］．Arthritis Rheum，2009，60(1):234-241．

［16］Guo F，Hutchenreuther J，Carter DE，et al．TAK1 is required for dermal wound healing and homeostasis［J］．J Invest Dermatol，2013，133(6):1646-1654．

［17］Sayama K，Hanakawa Y，Nagai H，et al．Transforming growth factor-beta-activated kinase 1 is essential for differentiation and the prevention of apoptosis in epidermis［J］．J Biol Chem，2006，281(31):22013-22020．

Morphology of Hypertrophic Scar Tissues and Expressions of Vascular Endothelial Growth Factor and Transforming Growth Factor Beta Activated Kinase 1 in These Tissues

ZHANG Yu-fei1，LI Hou-zhong2，WANG Xue-yong3，MA Hong-chuang1，WU Yan1，YUAN Xiao-huan1，CHU Yan-hui1

1Medical Research Center，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China2Department of Pharmacology，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China
3Department of Burn Surgery，the 209 Hospital of Chinese People’s Liberation Army，Mudanjiang，Heilongjiang 157011，China

Objective To observe the morphology of hypertrophic scar tissue and explore the expressions and distribution of vascular endothelial growth factor(VEGF)and transforming growth factor beta activatedkinase 1(TAK1)in these tissues．Method Hematoxylin-eosin staining，Masson staining，immunofluorescence，and real-time polymerase chain reaction were used to detect the localization and expression of VEGF and TAK1 in 15 hypertrophic scar tissues and 10 normal skin tissues．Results Morphological observation showed that the dermal fibroblasts in hypertrophic scar were disorderly and densely arranged(compared to the normal skin)．Immunofluorescence displayed that the expressions of VEGF and TAK1 in hypertrophic scar tissue were higher than in normal skin tissues．Real-time polymerase chain reaction showed the mRNA expressions of both VEGF and TAK1 were significantly higher in hypertrophic scar tissue than in normal tissue(P＜0．01，P＜0．05，respectively)．Conclusions Hypertrophic scar tissue has higher collagen fibrosis degree and higher TAK1 and VEGF expressions than the normal skin．VEGF and TAK1 can be used as the reference indicators for the diagnosis and differential diagnosis of hypertrophic scar and serve as new therapeutic targets．

hypertrophic scar;collagen fibrosis;vascular endothelial growth factor;transforming growth factor-beta-activated kinase 1

CHU Yan-hui Tel:0453-6984634，E-mail:yanhui_chu@sina．com

R619．6

A

1000-503X(2015)04-0446-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．04．014

2015-01-19)

初彥輝 電話:0453-6984634，電子郵件:yanhui_chu@sina．com

國家自然科學(xué)基金(81401599)和牡丹江市科學(xué)技術(shù)研究項目(Z2014s021)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81401599)and the Science and Technology Program of Mudanjiang(Z2014s021)