孫小兵，郭素娟

（北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京10083）

成齡板栗組培快繁體系的建立及影響因素的研究

孫小兵，郭素娟

（北京林業(yè)大學(xué) 省部共建森林培育保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京10083）

以遷西板栗主栽品種‘燕山早豐’為試材，采集其成齡樹上當(dāng)年抽生營養(yǎng)枝的莖段為外植體，研究了取樣時(shí)期、基本培養(yǎng)基種類及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)板栗不定芽誘導(dǎo)的影響，并采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)增殖培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果表明：（1）外植體最佳取材時(shí)間為新梢旺盛生長(zhǎng)期到半木質(zhì)化期，即5月初至6月上旬；（2）不定芽誘導(dǎo)最佳基本培養(yǎng)基為MS，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最佳激素組合為6-BA2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)80%以上；（3）最佳增殖培養(yǎng)基為GD+ZT2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá)3.24。

板栗‘燕山早豐’；莖段；離體培養(yǎng)；增殖培養(yǎng)；正交試驗(yàn)

板栗Castanea mollissimaBl.屬于殼斗科Fagaceae栗屬CastaneaMill植物，原產(chǎn)我國，在我國分布范圍很廣，并且不與糧農(nóng)作物爭(zhēng)地，是我國三大木本糧食樹種之一。其營養(yǎng)價(jià)值豐富，兼具經(jīng)濟(jì)效益與生態(tài)效益，具有重要的發(fā)展前景。中國板栗主要利用它的堅(jiān)果，其果實(shí)富含淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂肪及多種維生素和礦物質(zhì)，甘甜可口,并具有保健功效。中國板栗堅(jiān)果品質(zhì)高居各種栗的首位，尤其是北方板栗淀粉含量高，品質(zhì)優(yōu)良[1-3]?，F(xiàn)今，栗實(shí)已成為是我國出口創(chuàng)匯的主要干果之一。

‘燕山早豐’Castanea mollissima‘Yanshanzaofeng’是‘中國的板栗之鄉(xiāng)’河北省唐山市遷西縣的主栽品種，具有果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良、豐產(chǎn)性好、成熟期早、抗病、耐旱特點(diǎn)，是一個(gè)極受栗農(nóng)歡迎的早實(shí)優(yōu)良品種。但實(shí)際生產(chǎn)過程中，人們普遍沿用實(shí)生繁殖的方式，實(shí)生后代性狀變異復(fù)雜，造成良種化程度低[4-5]。而通過組織培養(yǎng)可以快速繁殖，建立板栗良種繁育體系。目前，關(guān)于栗屬植物組織培養(yǎng)國外已有大量報(bào)道[6-9]，但國內(nèi)關(guān)于板栗組織培養(yǎng)的研究較少，主要研究有板栗無菌體系建立[10-11]及再生體系的建立[12]，‘錐栗’的愈傷組織誘導(dǎo)[13]，胚珠培養(yǎng)[14]，‘燕山紅栗’的種胚培養(yǎng)[15]等。然而，目前尚無關(guān)于‘中國的板栗之鄉(xiāng)’遷西縣的主栽品種‘燕山早豐’組織培養(yǎng)研究的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用‘燕山早豐’成齡樹上當(dāng)年抽生營養(yǎng)枝作為外植體，對(duì)其組培快繁體系的建立及增殖培養(yǎng)進(jìn)行研究，以期為我國板栗育種和種苗繁殖提供理論依據(jù)和實(shí)踐支撐，并為再生體系的建立及后續(xù)基因轉(zhuǎn)化等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2013年4月25日至7月9日，在河北省唐山市遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心板栗品種園（118°20′E，39°42′N），選取生長(zhǎng)健壯，莖芽飽滿，無病蟲害的‘燕山早豐’優(yōu)良結(jié)實(shí)單株（嫁接4 a）為母株，采集其當(dāng)年抽生營養(yǎng)枝作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

根據(jù)前期預(yù)備試驗(yàn),確定用5%的次氯酸鈉（NaClO）溶液滅菌20 min，具體操作參照侯競(jìng)薇[12]的操作步驟。

1.2.2 母株取材時(shí)期

從2013年4月25日至7月09日，每隔約15 d取材一次，共設(shè)6個(gè)取材時(shí)期，分別為：4月25、5月10日、5月25日、6月09日、6月24日、7月09日，其中4月25取芽膨大期的枝條放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，以經(jīng)水培后萌發(fā)的莖段為外植。MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA1.0 mg·L-1、蔗糖 30 g·L-1、瓊脂 7 g·L-1，pH5.6 ～ 5.8，以下未特別說明，均用此培養(yǎng)基。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。放在組培室培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率和萌發(fā)率。

1.2.3 基本培養(yǎng)基篩選

2013年5月中旬取樣，采用MS、WPM、GD、SH、DKW、B5、LS、Miller、White 9種木本植物常用培養(yǎng)基，考察不同基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。培養(yǎng)基中均添加6-BA1.0 mg·L-1、蔗糖 30 g·L-1、瓊脂 7 g·L-1，pH5.6 ～ 5.8。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次。放在組培室培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，并觀察記錄生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)正交試驗(yàn)

采用L9(34)正交設(shè)計(jì)（參見表1），篩選不定芽誘導(dǎo)過程中最佳激素配比。以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加如表1所示的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，蔗糖 30 g·L-1、瓊脂 7 g·L-1，pH5.6 ～ 5.8。每瓶接種1個(gè)外植體，每個(gè)處理40株，重復(fù)2次。接種后置于組培室培養(yǎng)4周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，觀察記錄生長(zhǎng)狀況。

表1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合誘導(dǎo)不定芽的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L9(34) orthogonal design for different hormone combinations of induction of adventitious bud

1.2.5 繼代培養(yǎng)正交試驗(yàn)

采用L9(34)正交設(shè)計(jì)（見表2），將萌發(fā)的不定芽（無菌材料）剪成1.0 cm小段，接種于正交設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH5.6～5.8，每個(gè)處理40株，重復(fù)2次。接種后置于組培室培養(yǎng)4周，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，觀察記錄生長(zhǎng)狀況。

表2 不同激素組合誘導(dǎo)增殖的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 L9(34) orthogonal design for induced proliferation with different hormone combinations

1.2.6 培養(yǎng)條件

組培室溫（24±1）℃，空氣相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光周期為光培養(yǎng)16 h（6:00～22:00）和暗培養(yǎng)8 h（22:00～6:00）。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)采用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、SPSS18.0進(jìn)行方差分析，Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 母株取材時(shí)期對(duì)板栗無菌體系建立的影響

從表3可以看出，萌發(fā)率受污染率和褐化率共同影響，且不同生長(zhǎng)時(shí)期外植體的污染率、褐化率和萌發(fā)率有顯著差異（p＜0.01）。從圖1可以看出，污染率隨著取材時(shí)間的推移而升高，4月25日取材的污染率顯著低于其它處理。褐化率在4月25日至5月25日取樣時(shí)期最低，且與其它取樣時(shí)期差異顯著少。而萌發(fā)率隨時(shí)間的推移先升高再降低，5月10日和5月25日萌發(fā)率最高分別為61.11%和63.33%。6月09日萌發(fā)率為34.45%，不定芽的誘導(dǎo)率僅次于5月份。而6月09日后新梢開始停止生長(zhǎng)，含內(nèi)生菌較多，污染率和褐化率增高、萌發(fā)率下降，不再適宜進(jìn)行板栗的初代培養(yǎng)。

表3 不同取材時(shí)間對(duì)板栗不定芽啟動(dòng)培養(yǎng)污染率、褐化率、萌發(fā)率影響的多重比較Table 3 Multiple comparisons of effects of different sampling time on chestnut shoots start culture contamination rate, browning rate, germination rate

圖1 不同取材時(shí)期對(duì)不定芽誘誘導(dǎo)的影響Fig.1 Effects of different sampling periods on induction of adventitious bud

所以，綜合來看，生長(zhǎng)季節(jié)板栗莖段初代培養(yǎng)外植體最佳取材時(shí)期以5月初到6月初最好，即新梢旺盛生長(zhǎng)期到新梢半木質(zhì)化期，此期間的枝條未木質(zhì)化，營養(yǎng)充足，適宜做板栗組織培養(yǎng)的外植體。

2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

從圖2可以看出，板栗帶芽莖段接種在9種基本培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出不定芽，但不定芽誘導(dǎo)率差異顯著。其中萌發(fā)率最高的培養(yǎng)基為MS和SH，萌發(fā)率最分別為82.22%、81.11%。而GD萌發(fā)率最低僅為48.89%，其它培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)情況介于中間水平。由表4可知，MS和SH不定芽誘導(dǎo)率顯著高于其它培養(yǎng)基，但MS和SH培養(yǎng)基之間不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著。芽生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基為MS、SH、B5，不定芽在MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)健壯，翠綠色，長(zhǎng)勢(shì)好。在WPM、B5培養(yǎng)基中，莖段基部產(chǎn)生大量的愈傷組織。而接種在GD培養(yǎng)基上的莖段只誘導(dǎo)出了少量不定芽，且長(zhǎng)勢(shì)差，有一定的褐化現(xiàn)象。所以，綜合芽的平均誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況來看，不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS。

圖2 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響Fig.2 Effects of different culture mediums on induction of adventitious buds

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響?Table 4 Effects of different culture mediums on induction of adventitious buds

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

如表5所示，不同激素組合顯著影響不定誘導(dǎo)率（p＜0.01）。從表6可以看出，當(dāng)細(xì)胞分裂素為6-BA時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到82.59%，極顯著高于其他水平。當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為75.93%，高于其他水平，但差異不顯著。而對(duì)于生長(zhǎng)素來說，當(dāng)以IBA為生長(zhǎng)素時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率為78.33%，顯著高于其他生長(zhǎng)素的處理，添加一定量的生長(zhǎng)素有利于不定芽的誘導(dǎo)，當(dāng)生長(zhǎng)素濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高為80.19%，然而隨著生長(zhǎng)素濃度的提高，不定芽的誘導(dǎo)率卻明顯呈下降趨勢(shì)。

表5 不同激素組合誘導(dǎo)不定芽的L9(34)正交試驗(yàn)方差分析Table 5 Variance analysis of different hormone combinations rate to adventitious buds

表6 不同激素組合不定芽誘導(dǎo)率的多重比較Table 6 Multiple comparisons of different hormone combinations to induction rate of adventitious buds

從極差值R(表6)直觀分析可知，試驗(yàn)所考察的4個(gè)因素中，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素共同使用比單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素時(shí)不定芽誘導(dǎo)效果好。其中細(xì)胞分裂素種類對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響最大，細(xì)胞分裂素濃度對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響最小。比較各水平均值，得知A1B3C2D2利于不定芽誘導(dǎo),即6-BA2.0 mg·L-1+IBA0.1 mg·L-1配合使用。

2.4 培養(yǎng)基對(duì)增殖的影響

如表7所示，不同培養(yǎng)基及激素組合顯著影響了增殖系數(shù)(p＜0.01)。從表8的以看出，不同培養(yǎng)基種類對(duì)增殖有顯著影響，當(dāng)培養(yǎng)基為GD培養(yǎng)基時(shí)，增殖系數(shù)為3.24，極顯著高于其他水平。當(dāng)ZT濃度為1.5 mg·L-1和mg·L-1時(shí)，增殖系數(shù)分別為2.41和2.53差異不顯著。生長(zhǎng)素NAA濃度為0.1時(shí)，增殖系數(shù)最大。

從極差值R(表8)直觀分析可知，試驗(yàn)所考察的4個(gè)因素組合中，A2B3C1D1的增殖效果最好，增殖系數(shù)最高 ,即 GD+ZT2.0 mg·L-1+NAA mg·L-1。在該培養(yǎng)其上，外植體經(jīng)培養(yǎng)15 d左右即可誘導(dǎo)出新的腋芽。

表7 不同培養(yǎng)基及激素組合的培養(yǎng)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)各處理增殖系數(shù)的方差分析Table 7 Variance analysis of different combinations of hormone and culture mediums to multiplication factors

表8 不同培養(yǎng)基及激素組合增殖系數(shù)的多重比較Table 8 Multiple comparisons of different media and hormone combinations to multiplication factors

3 結(jié)論與討論

（1）母株取材時(shí)期直接影響離體培養(yǎng)的結(jié)果。板栗是多年生木本植物，枝條暴露在田間，菌類滋生，還有的細(xì)菌甚至滲透到組織內(nèi)部，因此，試驗(yàn)中外植體即使經(jīng)過細(xì)致的表面滅菌，仍然有污染情況出現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外植體取材最佳時(shí)間是新梢旺盛生長(zhǎng)期到新梢半木質(zhì)化期，此時(shí)采集的外植體材料所含細(xì)菌少，生活力強(qiáng)，對(duì)外源激素敏感，反應(yīng)強(qiáng)，分化能力也較強(qiáng)。

（2）在前人的研究中，板栗組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重[16]。這主要是因?yàn)榘謇躞w內(nèi)含有酚類物質(zhì)單寧[17]，當(dāng)外植體組織受到損傷時(shí)酚類物質(zhì)被氧化成醌，導(dǎo)致褐化現(xiàn)象。但本實(shí)驗(yàn)中褐化現(xiàn)象對(duì)板栗組培體系建立的影響較小，分析原因可能有兩點(diǎn)：其一，基因型不同?；蛐褪怯绊懡M織培養(yǎng)效果的重要因素，本實(shí)驗(yàn)的板栗品種“燕山早豐”可能在抗褐化方面更具優(yōu)勢(shì)。其二，滅菌方法不同。本實(shí)驗(yàn)采用NaClO溶液滅菌，雖然NaClO溶液的滅菌效果不及HgCl2[18]，但是NaClO對(duì)外植體組織的傷害也較小，這可能也是本實(shí)中褐化現(xiàn)象較輕的原因。

（3）基本培養(yǎng)基提供了植物生長(zhǎng)發(fā)育所需的營養(yǎng)元素，但因?yàn)楦鞣N植物的遺傳特性、生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特性不一致，所以它們對(duì)營養(yǎng)的要求也不相同，基本培養(yǎng)基的優(yōu)化篩選極為重要[19-21]。本實(shí)驗(yàn)采用MS、WPM、GD、SH、DKW、B5、LS、Miller、White 9種木本植物常用培養(yǎng)基，考察不同基本培養(yǎng)基對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：莖段初代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，MS和SH培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率最高，二者均為高硝態(tài)氮的培養(yǎng)基，這與任鵬的研究結(jié)果一致[22]。

（4）生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的運(yùn)用及其濃度大小直接影響外植體生長(zhǎng)和分化的方向。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素共同使用對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果較好，其中 6-BA2.0 mg·L-1+IBAmg·L-1組合不定芽誘導(dǎo)效果好。

（5）增殖培養(yǎng)中，GD培養(yǎng)基適于板栗增殖培養(yǎng)，增殖效果顯著優(yōu)于其它培養(yǎng)基，這可能是由于GD培養(yǎng)基中含有L-谷氨酰胺，能有效促進(jìn)外植體內(nèi)一些蛋白質(zhì)的合成。其中以GD+ZT2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1的培養(yǎng)基效果最好。

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Establishment and inf l uencing factors of micropropagation system in matureCastanea mollissima

SUN Xiao-bing, GUO Su-juan
(Key Lab. for Silviculture and Conservation Co-constructed by China Education Ministry and Beijing, Beijing Forestry University,Beijing 100083, China)

By taking variety ‘Yanshanzaofeng’ from Qianxi County of Hebei province as tested material, the tested mature tree’s current-year-birth nutrition branches nodal segments were collected as explants to study the effects of combination of sampling period,type of basic culture medium and plant growth regulator on adventitious bud induction of Chinese chestnut. The multiplication mediums of tested trees were optimized and selected by sifting through L9(34) orthogonal tests. The results show that (1) the optimal collecting period of stem primary was from early May to early June, in which were the vigorous shoots growing into semi-woody periods; (2)the best basic medium for adventitious bud induction was MS medium, the best hormone combination screened out by orthogonal test was 6-BA2.0 mg·L-1+ IBA0.1 mg·L-1, the induction rate was over 80%; (3) the optimal proliferation medium was GD + ZT2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1, the multiplication factor was up to 3.24.

Castanea mollissima‘Yanshanzaofeng’; nodal segments; isolated culture; proliferation culture; orthogonal test

S722.3+7

A

1673-923X(2015)04-0051-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.04.009

2013-11-15

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)重大項(xiàng)目“板栗產(chǎn)業(yè)鏈環(huán)境友好豐產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201204401）

孫小兵，碩士研究生 通訊作者：郭素娟，教授，博士生導(dǎo)師； E-mail：gwangzs@263.com

孫小兵,郭素娟.成齡板栗組培快繁體系的建立及影響因素的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2015,35(4):51-55.

[本文編校：文鳳鳴]