譚健暉，黃壽先

(1.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530005)

大花序桉離體根培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素的變化

譚健暉1，黃壽先2

(1.廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2.廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530005)

利用大花序桉組培繼代苗為材料，研究外源激素對離體根培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化過程。結(jié)果表明：添加外源激素NAA和IBA，與無激素培養(yǎng)基間達(dá)到極顯著差異；20d前后為根原基形成時期，30d前后為根原基分化增殖時期，40d前后為根原基伸長時期；不同激素對生根起重要調(diào)控作用，高IAA、ABA、iPa和低ZR含量促進(jìn)根原基的形成；低IAA、ABA、iPa和高ZR含量促進(jìn)根原基分化增殖；低IAA、ABA、iPa和低ZR含量促進(jìn)根原基伸長。

大花序桉；組培繼代苗；離體根培養(yǎng)；根原基；外源激素；內(nèi)源激素

大花序桉Eucalyptus cloeziana屬桃金娘科Myrtaceae桉屬Eucalyptus。大花序桉僅天然分布于澳大利亞的昆士蘭州，故此又名昆士蘭桉。大花序桉先后引種于多個國家和地區(qū)，并表現(xiàn)出較大的生產(chǎn)潛力，大花序桉有別于其它桉樹的一個重要特點(diǎn)是其木材黃褐色，結(jié)構(gòu)緊密，沉重堅固，是很好的室內(nèi)裝飾和鋸材，適合進(jìn)行大徑材培養(yǎng)[1]。由于大花序桉在我國引種少，開花結(jié)實少，且大花序桉屬異花風(fēng)蟲媒樹種，種間種內(nèi)易雜交，子代分化很大，因此，無性繁殖成為大花序桉良種繁育的重要手段。大花序桉組織培養(yǎng)與巨桉、尾葉桉及其雜交種相比存在較大難度，難以規(guī)模化應(yīng)用的主要技術(shù)瓶頸是生根困難且生根時間長[2]，因此大花序桉的組織培養(yǎng)多數(shù)研究仍處于實驗室階段[2-4]。筆者利用基本培養(yǎng)基、IAA和NAA等3因素4水平的正交試驗選出大花序桉離體根培養(yǎng)中生根率最高的組合，并研究該培養(yǎng)基在根培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化，揭示大花序桉離體根培養(yǎng)的內(nèi)源激素機(jī)制，有效地避免大花序桉離體培養(yǎng)的盲目性和隨意性，為大花序桉離體根培養(yǎng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選擇大花序桉第29代生長一致的繼代苗，分別于添加外源生長素NAA、IBA和無外源生長素的培養(yǎng)基上進(jìn)行離體根培養(yǎng)。離體生根培養(yǎng)基為1/3改良MS+NAA2.0mg/L+ IBA0.5mg/L(對照培養(yǎng)基為1/3改良MS)，蔗糖20g/L，7.5g/L瓊脂條，調(diào)節(jié)pH值至5.6～5.8，121℃1.1kg/cm2下滅菌20min。培養(yǎng)溫度為24℃，光照時間12h/d，光照強(qiáng)度1 500 lx左右。

以40d為一個培養(yǎng)周期，每10d進(jìn)行一次取樣，將試管苗從瓶內(nèi)取出，剪取莖葉部分，試管苗避免沾帶培養(yǎng)基，將實驗材料裝在封口袋內(nèi)，標(biāo)注取樣時間和樣品號，放在-80℃超低溫冰箱中保存，待取樣結(jié)束統(tǒng)一進(jìn)行激素測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 內(nèi)源激素的提取

大花序桉試管苗1.0g→加2mL樣品提取液→冰浴下研磨勻漿→4℃提取4h→10 000 r/min離心15min→取上清液。上清液過80％甲醇柱→上樣→收集樣品→100％甲醇洗柱→100％乙醚洗柱→100％甲醇洗柱→循環(huán)。過柱后的樣品，真空濃縮干燥，除去提取液中的甲醇，用樣品稀釋液定容。

1.2.2 內(nèi)源激素的測定

包被→洗板→競爭→加標(biāo)樣及待測樣→加抗體→洗板→加二抗→洗板→加底物顯色→終止反應(yīng)→比色。計算公式為：

式中：B0是0 ng/mL孔的顯色值；B是其它濃度的顯色值。

2 結(jié)果與分析

2.1 根形態(tài)建成過程中內(nèi)源激素IAA含量的變化

大花序桉根培養(yǎng)過程中對照和處理的IAA含量變化趨勢大體相同，呈單峰變化趨勢，處理和對照的IAA含量峰值分別出現(xiàn)在第20天和第30天(見圖1)。由表1可知，培養(yǎng)初期對照IAA含量略高于處理，但處理IAA含量隨后迅速增加，在20d時超過對照，于第30天達(dá)到峰值，然后開始下降至80 ng/g以下，對照的IAA含量在50～80 ng/g間波動，起伏不大。IAA參與根的形態(tài)建成，與根原基的形成和萌發(fā)密切相關(guān)，是大花序桉根發(fā)育的關(guān)鍵激素之一。高IAA含量有利于根的形成，通過添加外源生長素IBA和NAA，可以調(diào)節(jié)內(nèi)源激素IAA的含量，與其它激素協(xié)同作用于大花序桉的形態(tài)建成過程，使細(xì)胞朝著有利于根的方向分化。

圖1 根形態(tài)建成過程中IAA含量的變化Fig.1 IAA content changes in process of root vitro culture

表1 4種內(nèi)源激素多重統(tǒng)計分析?Table 1 Variance analysis on different endogenous hormones

2.2 根形態(tài)建成過程中內(nèi)源激素ZR含量的變化

大花序桉根培養(yǎng)過程中對照和處理的ZR含量呈單峰變化趨勢，處理和對照的ZR含量峰值分別出現(xiàn)在第30和第20天(見圖2)。離體培養(yǎng)初期，大花序桉根發(fā)育過程中ZR含量對照明顯高于處理，隨著培養(yǎng)時間的延長，處理和對照含量趨于接近。處理的ZR含量只在第30天略高于對照，從ZR的動態(tài)變化看，處理中ZR含量在10～21 ng/g間波動，變化平緩，起伏不大，而對照的ZR含量在15～55 ng/g間波動，起伏大，變化劇烈。低ZR含量有利于根的形成，通過添加外源生長素IBA和NAA，可以調(diào)節(jié)內(nèi)源激素ZR的含量，使細(xì)胞朝著有利于根的方向分化。

圖2 根形態(tài)建成過程中ZR含量的變化Fig.2 ZR content changes in process of root vitro culture

2.3 根形態(tài)建成過程中內(nèi)源激素ABA含量的變化

大花序桉根培養(yǎng)過程中對照和處理的ABA含量變化大體一致，呈降低—升高—降低的單峰變化趨勢(見圖3)，培養(yǎng)初期對照的ABA含量略高于處理，之后處理的ABA含量出現(xiàn)明顯升高，第20天時兩者均出現(xiàn)峰值，分別為236.97 ng/g和500.26 ng/g，處理高于對照1倍以上，培養(yǎng)中后期ABA含量均出現(xiàn)下降，但處理的ABA含量一直處在較高水平。從ABA含量動態(tài)變化曲線來看，處理的ABA含量不同培養(yǎng)時期變化明顯，而對照中的含量變化平緩，起伏不大，表明ABA是大花序桉根發(fā)育的關(guān)鍵激素之一，參與根的形態(tài)建成，與根原基的形成和萌發(fā)密切相關(guān)。高ABA含量有利于根的形成，通過添加外源生長素IBA和NAA，可以調(diào)節(jié)內(nèi)源激素ABA的含量，與其它激素協(xié)同作用于大花序桉的形態(tài)建成過程，使細(xì)胞朝著有利于根的方向分化。

圖3 根形態(tài)建成過程中ABA含量的變化Fig.3 ABA content changes in process of root vitro culture

2.4 根形態(tài)建成過程中內(nèi)源激素iPa含量的變化

大花序桉根培養(yǎng)過程中對照和處理的iPa含量變化情況大體相反，從曲線上看，處理的變化趨勢是下降—升高—下降，對照的變化趨勢是升高—下降—升高—下降(見圖4)。從iPa含量動態(tài)變化曲線看，在離體培養(yǎng)初期，處理的iPa含量下降，在第10天后開始逐漸地增加，逐漸高于對照，在第20天達(dá)到最高值，第30天含量呈現(xiàn)下降趨勢，第40天含量低于對照，說明外源生長素的加入在前期抑制了iPa含量的增加，而在培養(yǎng)中期內(nèi)源激素iPa含量明顯上升，在培養(yǎng)后期iPa含量出現(xiàn)下降。表明iPa是大花序桉根發(fā)育的關(guān)鍵激素之一，高iPa有利于根的形成，通過添加外源生長素IBA和NAA，可以調(diào)節(jié)內(nèi)源激素iPa的含量，與其它激素協(xié)同作用于大花序桉的形態(tài)建成過程，使細(xì)胞朝著有利于根的方向分化。

圖4 根形態(tài)建成過程中iPa含量的變化Fig.4 iPa content changes in process of root vitro culture

3 討論與結(jié)論

植物不定根的發(fā)生發(fā)展是一個極其復(fù)雜的生理生化過程。它的誘導(dǎo)、發(fā)生和形成與解剖學(xué)結(jié)構(gòu)、內(nèi)源生長素或其他促根物質(zhì)、內(nèi)源抑制物等多種生理生化反應(yīng)相關(guān)[5-7]。植物激素是控制植物生長發(fā)育的最重要物質(zhì)之一，影響植物的關(guān)鍵生物過程，如胚胎、根、花的發(fā)育，維管分化，頂端優(yōu)勢，向性反應(yīng)等[8]。近年來，內(nèi)源激素的研究多集中于無性繁殖方面[9-15]。傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)側(cè)重研究不同外源激素配比對器官培養(yǎng)和分化的影響，但對于難生根樹種而言,僅依靠外源激素的調(diào)節(jié)往往帶著不同程度的盲目性，無法取得理想效果，筆者從不同離體根培養(yǎng)時期內(nèi)源激素的動態(tài)變化角度研究外源生長素對內(nèi)源激素和根形態(tài)建成的影響，以期為大花序桉根離體培養(yǎng)中外源激素的添加提供科學(xué)依據(jù)。

本實驗在1/3改良MS+NAA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖25g+瓊脂7.5g的培養(yǎng)條件下，添加外源激素NAA和IBA，與無激素培養(yǎng)基間達(dá)到極顯著差異。從離體根培養(yǎng)的整個過程看，添加外源激素NAA和IBA，第20天內(nèi)源激素IAA、ABA和iPa含量達(dá)到最高峰值，內(nèi)源激素ZR出現(xiàn)最低峰值，且第20天時對照與處理間差異最大，說明20d前后為根原基形成時期，30d前后為根原基分化增殖時期，40d前后為根原基伸長時期。

根原基的形成、分化和增殖是離體根培養(yǎng)的關(guān)鍵時期，這一過程的不同時期有不同的激素要求，本實驗中大花序桉離體根培養(yǎng)在根原基形成前后，內(nèi)源激素IAA、ABA和iPa含量出現(xiàn)最高峰值，說明提高這3種激素的含量有利于根原基的形成，含量較高，對生根較有利；內(nèi)源激素ZR含量則出現(xiàn)最低值，說明降低ZR含量有利于根原基的形成，簡言之，不同激素對生根起重要調(diào)控作用，高IAA、ABA、iPa和低ZR含量促進(jìn)根原基的形成；低IAA、ABA、iPa和高ZR含量促進(jìn)根原基分化增殖；低IAA、ABA、iPa和低ZR含量促進(jìn)根原基伸長。

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Change of endogenous hormones in process of root in-vitro culture of Eucalyptus cloeziana

TAN Jian-hui1,HUANG Shou-xian2
(1.Guangxi Forestry Research Institute,Nanning 530002,Guangxi ,China; 2.College of Forestry,Guangxi University,Nanning 530005,Guangxi,China)

By taking Eucalyptus cloeziana tissue culture subculture seedlings as the tested materials,the dynamic effecting processes of exogenous hormone on endogenous hormones in the process of in-vitro root culture of the seedlings were investigated.The results indicate that the seedlings of adding exogenous hormones of NAA and IBA to the culture medium had significant differences with hormone-free medium seedling; Twenty days time was the root primordia formation period,thirty-days time was the differentiation and proliferation period,forty-days time was the elongation period of adventitious root primodium; The every kinds of hormones played important regulatory roles for the seedlings rooting; High endogenous of IAA,ABA,iPa and low levels of ZR promoted the formation of primordial rooting; Low endogenous of IAA,ABA,iPa and high levels of ZR promoted the differentiation and proliferation of primordial rooting; Low endogenous of IAA,ABA,iPa and low levels of ZR promoted the elongation of adventitious root primordium.

Eucalyptus cloeziana; tissue culture subculture seedlings; in-vitro root culture; root primordium；exogenous hormone;endogenous hormones

S722.3+7；S792.39

A

1673-923X(2015)01-0034-03

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.01.007

2013-10-08

廣西自然基金項目(2011GXNSFA018095)

譚健暉，教授級高工；E-mail：tanjianhui94@126.com

譚健暉，黃壽先.大花序桉離體根培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素變化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2015,35(1):34-36,55.

[本文編校：謝榮秀]