張建偉

（唐山師范學(xué)院體育系，河北 唐山 063000）

明日葉查耳酮對Ⅱ型糖尿病大鼠脂代謝的影響

張建偉

（唐山師范學(xué)院體育系，河北 唐山 063000）

目的：研究明日葉查耳酮和游泳運(yùn)動對Ⅱ型糖尿病大鼠脂代謝的影響。方法：注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠糖尿病模型，觀察補(bǔ)充明日葉查耳酮、游泳運(yùn)動、游泳運(yùn)動結(jié)合補(bǔ)充明日葉查耳酮，以及陽性藥物二甲雙胍對糖尿病大鼠血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平的影響，以及對肝臟內(nèi)脂素（visfatin）mRNA、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶-1（glycerol-3-phosphate acyltransferase-1，GPAT-1）mRNA、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transferase-1，CPT-1）mRNA相對表達(dá)量的影響。結(jié)果：與糖尿病組比較，各干預(yù)組大鼠的TG 、TC、LDL、FFA水平顯著下降，HDL水平顯著升高；各干預(yù)組大鼠肝臟visfatin mRNA、GPAT-1 mRNA相對表達(dá)量顯著下降；肝臟CPT-1 mRNA相對表達(dá)量則均顯著升高。結(jié)論：明日葉查耳酮有很好的改善糖尿病大鼠脂代謝的能力，并且與游泳運(yùn)動產(chǎn)生協(xié)同效果。

明日葉查耳酮；運(yùn)動；糖尿??；脂代謝

Ⅱ型糖尿病（type Ⅱ diabetes mellitus，T2DM）是以高血糖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為主要特征的代謝性疾病[1]。而飲食的高糖高脂、日常運(yùn)動過少等因素都是糖尿病形成的主要原因。傳統(tǒng)的西藥治療常常使患者的用藥量隨著用藥時間的延長而逐漸增加，投入的藥物種類也常由單一逐漸變?yōu)槁?lián)合，而藥量增加與同時服用多種降糖藥都不可避免地導(dǎo)致了對肝臟和腎臟的毒副作用，又會使患者對藥物產(chǎn)生依賴作用[2]。隨著病情的發(fā)展，許多病人又不斷出現(xiàn)多種并發(fā)癥。這些問題出現(xiàn)的原因在于糖尿病導(dǎo)致的體質(zhì)變化未得到改善，提供了并發(fā)癥的生理基礎(chǔ)，這些發(fā)生于全身的病變正是西藥治療的薄弱環(huán)節(jié)[3]。

當(dāng)今，運(yùn)動和飲食調(diào)節(jié)對糖尿病的治療作用越來越受到人們的重視。運(yùn)動可以促進(jìn)體內(nèi)糖脂代謝，從而加速葡萄糖分解。天然保健食品往往含有多種有益健康的成分，大多為藥食兼用的動、植物性食品，對人體的毒副作用小，也不會產(chǎn)生耐藥性，藥性溫和，并可以通過對機(jī)體的全方位調(diào)理達(dá)到滋陰清熱、補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的目的，降低血糖水平，改善糖尿病癥狀，延長糖尿病人壽命。

鑒于飲食和運(yùn)動調(diào)節(jié)對糖尿病預(yù)防的重要意義，本研究探討補(bǔ)充明日葉查耳酮和游泳運(yùn)動對改善T2DM大鼠肝臟脂代謝的可能影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（180.0±18.8）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

明日葉查耳酮、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）美國Sigma公司。

鹽酸二甲雙胍緩釋片 哈爾濱同一堂藥業(yè)公司；血清甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipoprptein，HDL）測定試劑盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）測定試劑盒、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；RNAstore樣品保存液、血清內(nèi)脂素（visfatin）檢測試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒SYBR FAST qPCR Kit 天根生化科技（北京）有限公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrirneScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S22PC分光光度計、DYY-Ⅲ31A/31B型電泳槽北京六一儀器廠；ABI 2720 PCR儀 美國Applied Biosystems PE公司；DNA Engine PCR儀、Quantityone凝膠分析軟件 美國Bio-Rad公司；VILBER LOURMAT熒光-化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 法國Vilber公司。

1.3 方法

1.3.1 T2DM大鼠模型制備、分組及運(yùn)動訓(xùn)練方案

將65 只雄性SD大鼠普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對照組（NC組，8只）和造模組（57 只）。正常對照組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，造模組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，高糖高脂飼料包括（以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）20%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、64.8%基礎(chǔ)飼料。給予造模組大鼠高糖高脂飼料5 周后，按照35 mg/kg（以體質(zhì)量計，下同）腹腔注射STZ，并繼續(xù)維持高糖高脂飲食。正常對照組大鼠注射同等劑量的檸檬酸鈉緩沖液。注射3、7 d后，從各組大鼠尾靜脈取血測定隨機(jī)血糖濃度，血糖濃度均大于16.7 mmol/L為造模成功大鼠。本實(shí)驗(yàn)中，造模成功率為89.1%。

選取造模成功的SD大鼠40 只，隨機(jī)分為5 組：糖尿病組（DM組）、二甲雙胍組（S組，50 mg/（kg·d））、明日葉查耳酮組（CA組，20 mg/（kg·d））、運(yùn)動組（CE組）、明日葉查耳酮+運(yùn)動組（CACE組，20 mg/（kg·d）），每組8 只，正常對照組大鼠灌胃等劑量的無菌水。各組灌胃給藥均于每天下午17：00左右進(jìn)行，之后以普通飼料繼續(xù)喂養(yǎng)各組大鼠8 周并進(jìn)行運(yùn)動訓(xùn)練。

運(yùn)動訓(xùn)練采取8 周不負(fù)重的游泳訓(xùn)練。先進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性訓(xùn)練（10 min/d），之后進(jìn)行正式訓(xùn)練，訓(xùn)練時間為：第1周15 min/d、第2周30 min/d、第3～8周45 min/d，每周訓(xùn)練6 d。游泳訓(xùn)練在白色大水桶中完成，每桶4 只大鼠，水深60 cm，水溫（32±2）℃，每次游泳結(jié)束立即用干毛巾將大鼠體表水分輕柔擠壓吸干。

1.3.2 樣品制備

運(yùn)動訓(xùn)練8 周后，各組大鼠眼球取血，分離得血清備用。取血后脫頸處死大鼠，迅速取肝臟用錫紙包裹投入液氮冷凍，之后保存于－80 ℃冰箱備用。

1.3.3 指標(biāo)測定

大鼠血清TG、TC、HDL、LDL、FFA含量均采用試劑盒測定，具體操作步驟按照說明書方法進(jìn)行。

肝臟組織visfatin mRNA、甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶-1（glycerol-3-phosphate acyltransferase-1，GPAT-1）mRNA及肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine palmitoyl transferase-1，CPT-1）mRNA相對含量的測定：Trizol法提取肝臟細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法操作獲取cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增。將β-actin作為內(nèi)參基因，visfatin作為目的基因。對GPAT-1 mRNA及CPT-1 mRNA的定量檢測中，以18S rRNA作為內(nèi)參基因。參考文獻(xiàn)[4-6]，用Primer5軟件設(shè)計引物，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。

visfatin mRNA相對含量的定量PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×SYBR Green Master Mix 1.5 μL、1 μmol/L正向引物0.2 μL、1 μmol/L反向引物0.2 μL、10 ng/μL cDNA模板1 μL，ddH2O 7.1 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

GPAT-1 mRNA及CPT-1 mRNA相對含量的定量PCR反應(yīng)體系（10 μL）：2×SYBR Green Master Mix 1.5 μL、1 μmol/L正向引物0.25 μL、1 μmol/L反向引物0.25 μL、10 ng/μL cDNA模板1.25 μL、ddH2O 6.25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s，62 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件，組間差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠脂代謝相關(guān)血液指標(biāo)的變化

表1 大鼠脂代謝相關(guān)血液指標(biāo)含量Table 1 Serum parameters of rats associated with lipid metabolism

由表1可知，與NC組比較，DM組大鼠血清TG、TC、LDL、FFA含量均極顯著升高（P＜0.01），HDL含量極顯著降低（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)8 周后，與DM組比較，S組大鼠血清TG、TC、LDL、FFA含量均極顯著下降（P＜0.01），HDL含量極顯著升高（P＜0.01）；CA組大鼠血清TG、TC含量極顯著下降（P＜0.01），LDL、FFA含量顯著下降（P＜0.05），HDL含量極顯著升高（P＜0.01）；CE組大鼠血清TG、TC含量均極顯著下降（P＜0.01），LDL、FFA含量顯著下降（P＜0.05），HDL含量極顯著升高（P＜0.01）；CACE組大鼠血清TG、TC、LDL含量均極顯著下降（P＜0.01），F(xiàn)FA含量顯著下降（P＜0.05），HDL含量極顯著升高（P＜0.01）。

2.2 大鼠肝臟visfatinmRNA相對表達(dá)量

圖1 各組大鼠肝臟visfatinfatin mRNA相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of visfatin mRNA in rats

由圖1可知，與NC組相比，DM組大鼠肝臟visfatin mRNA相對表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）；與DM組相比，S組、CACE組大鼠肝臟visfatin mRNA相對表達(dá)量均極顯著下降（P＜0.01），CA組及CE組顯著下降（P＜0.05）。

2.3 大鼠肝臟GPAT-1 mRNA相對表達(dá)量

圖2 各組大鼠肝臟GPAT-1 mRNA相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of GPAT-1 mRNA in rats

由圖2可知，與NC組相比，DM組大鼠肝臟GPAT-1 mRNA相對表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）；與DM組相比，S組大鼠肝臟GPAT-1 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01），而CA組、CE組及CACE組均顯著降低（P＜0.05）。

2.4 大鼠肝臟CPT-1 mRNA相對表達(dá)量

圖3 各組大鼠肝臟CPT--11 mRNA相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of CPT-1 mRNA in rats

由圖3可知，與NC組相比，DM組大鼠肝臟CPT-1 mRNA相對表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）；與DM組相比，S組、CA組、CE組及CACE組大鼠肝臟CPT-1 mRNA相對表達(dá)量均極顯著升高（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

明日葉是傘形科多年生草本植物，具有多種功效，如增強(qiáng)人體免疫力、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗菌消炎、降低血糖和血脂水平等[7]，其中降糖作用尤為顯著。明日葉中主要活性成分為查耳酮。查耳酮類化合物屬于黃酮類物質(zhì)，是一種植物色素，含有1,3-二苯基丙烯酮結(jié)構(gòu)。查耳酮類化合物具有多種生物學(xué)活性，如降血糖、降血脂、抗氧化等。目前，有很多關(guān)于明日葉查耳酮對糖尿病防治作用的研究，認(rèn)為查耳酮有很強(qiáng)的胰島素樣活性，能夠增強(qiáng)胰島素功能、降低血糖濃度[8]。

糖尿病患者一般都存在血脂異常的狀況，甚至發(fā)生脂肪肝病變。這與糖尿病患者在糖代謝異常的同時一般都伴隨脂代謝異常相關(guān)[9]。血脂代謝異常是糖尿病及其并發(fā)癥的主要危險因素。糖尿病的脂代謝異常典型表現(xiàn)為FFA、TG、TC、LDL水平升高，HDL水平降低。研究表明，脂代謝紊亂特別是TG和FFA水平增高是糖尿病的誘發(fā)因素[10]。糖尿病的早期癥狀之一常表現(xiàn)為TG水平升高[11]。FFA主要為皮下和內(nèi)臟脂肪脂解產(chǎn)生，分解產(chǎn)生的FFA在肝臟中作為底物合成TG。長期的高水平FFA易發(fā)生再脂化，并異位沉積于非脂肪器官，使周圍組織對胰島素敏感性降低，最終使胰島素分泌發(fā)生障礙[12]。因此，加速脂類分解，改善脂代謝狀況，既可以提高葡萄糖的利用率，又可以減少糖異生，從而降低血糖濃度，達(dá)到預(yù)防和治療糖尿病的目的。

運(yùn)動對血脂代謝的改善作用已經(jīng)得到了證實(shí)。尤其是中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動，可以通過改善機(jī)體氧化應(yīng)激來增加抗氧化酶的活力，從而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[13]。本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動組大鼠血清TG、TC、LDL、FFA水平都明顯降低，而HDL水平明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了前人的研究，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示明日葉查耳酮對糖尿病大鼠血清的脂代謝相關(guān)指標(biāo)也有顯著改善作用。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動與明日葉查耳酮表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，兩者配合可能對血脂指標(biāo)的改善作用更強(qiáng)。

Visfatin是Fukuhara等[14]在2005年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)臟脂肪細(xì)胞因子，在脂肪細(xì)胞分化和葡萄糖代謝中有特殊的重要作用。它具有類似胰島素樣的降血糖作用，并能促進(jìn)前內(nèi)臟脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)內(nèi)臟脂肪合成和聚集，可能參與肥胖等疾病的發(fā)生發(fā)展，是糖脂代謝重要影響因子[15-18]。本實(shí)驗(yàn)中，糖尿病組大鼠肝臟visfatin mRNA水平比正常對照組極顯著升高，可能是因?yàn)樘悄虿〈笫筇谴x異常，血糖水平的升高使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的代償反應(yīng)，各組織分泌更多visfatin，模擬胰島素降糖作用，以補(bǔ)充胰島素的相對不足，使作為調(diào)控機(jī)體糖代謝器官的肝臟中visfatin維持在較高水平。而各干預(yù)組與糖尿病組相比，肝臟visfatin mRNA水平都明顯下降，可能是各干預(yù)組都不同程度地降低了糖代謝異常的情況而使肝臟visfatin分泌減少，而且明日葉查耳酮與運(yùn)動的共同作用要優(yōu)于二者單獨(dú)使用的效果。

GPAT-1、CPT-1是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵酶[5,19]。GPAT-1可以將脂肪酸酯化為TG儲存起來[20]。CPT-1是脂肪酸氧化過程中的一種限速酶，催化脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)進(jìn)行β-氧化[21-22]。它位于線粒體外膜，通過過氧化物酶體增殖物激活受體、丙二酰輔酶A進(jìn)行磷酸化、脫磷酸化依賴的細(xì)胞骨架成分在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯及翻譯后水平接受調(diào)節(jié)，在能量代謝中起關(guān)鍵作用[23-24]。本研究中，糖尿病組大鼠肝臟的GPAT-1 mRNA水平比正常對照組極顯著升高，與血清TG水平的變化趨勢一致，說明糖尿病組大鼠脂肪酸酯化加強(qiáng)，致使轉(zhuǎn)化的TG含量增加。而明日葉查耳酮組大鼠肝臟的GPAT-1 mRNA水平比糖尿病組顯著降低，CPT-1 mRNA水平比糖尿病組顯著升高，表明明日葉查耳酮可能通過降低GPAT-1水平來減少TG的形成，同時提高GPAT-1水平而促進(jìn)脂肪酸β-氧化，降低TG水平。本研究結(jié)果表明，明日葉查耳酮與運(yùn)動對改善糖尿病大鼠脂代謝具有協(xié)同作用。

明日葉查耳酮能夠促進(jìn)大鼠體內(nèi)脂肪酸β-氧化，降低脂肪酸的酯化水平，加速脂類分解，改善脂代謝。雖然其作用弱于二甲雙胍，但是明日葉查耳酮可與運(yùn)動產(chǎn)生整體的協(xié)同效果。

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Effect of Ashitaba Chalcone on Lipid Metabolism of Rats with Type II Diabetes

ZHANG Jianwei
(Department of Physical Education, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

Objective: To study the effect of oral ashitaba chalcone and swimming exercise on lipid metabolism of rats with type II diabetes. Methods: Adult male streptozotocin-induced diabetic rats wer e subjected to swimming exercise and/or oral administration of ashitaba chalcone. Changes in the serum contents of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL), high density lipoprotein (HDL) and free fatty acid (FFA), and the relative mRNA expression levels of visfatin, glycerol-3-phosphate acyltransferase-1 (GPAT-1) and carnitine palmitoyl transferase-1 (CPT-1) in liver tissue were measured. Results: Compared with the diabetic model group, the serum levels of TG, TC, LDL and FFA contents were signifi cantly lower in the intervention groups, while the serum level of HDL was signifi cantly increased. The mRNA expression levels of visfatin and GPAT-1 in liver were remarkably decreased in the treated diabetic groups; however, the relative mRNA expression of CPT-1 in liver mRNA was signifi cantly enhanced. Conclusion: Ashitaba chalcones improve lipid metabolism in diabetic rats showing a synergistic effect with exercise intervention.

ashitaba chalcones; exercise; diabete; lipid metabolism

TS201.4

A

1002-6630（2015）19-0250-05

10.7506/spkx1002-6630-201519045

2014-11-12

唐山市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項(xiàng)目（14130254B）；河北聯(lián)合大學(xué)培育基金項(xiàng)目（SP201309；GP201524）

張建偉（1978-），男，講師，碩士，主要從事運(yùn)動訓(xùn)練學(xué)與運(yùn)動營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：353451852@qq.com