劉 歡，段文強，金 龍

（1.通化師范學院制藥與食品科學學院，長白山食品工程研究中心，吉林 通化 134000；2.通化市衛(wèi)生學校，吉林 通化 134000）

從長白山闊葉林中篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌及其酶學性質(zhì)研究

劉 歡1，段文強2，金 龍1

（1.通化師范學院制藥與食品科學學院，長白山食品工程研究中心，吉林 通化 134000；2.通化市衛(wèi)生學校，吉林 通化 134000）

利用馬丁氏培養(yǎng)基富集、PDA培養(yǎng)基純化和七葉靈培養(yǎng)基顯色，從長白山闊葉林中初步篩選出6 株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌。對真菌發(fā)酵生成的β-葡萄糖苷酶進行提取和純化，測得10號菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高為18.34 U/mL，形態(tài)學和分子學結合方法鑒定該菌株為草酸青霉（Penicillium oxalicum）。該菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶最適反應溫度約為55 ℃，在溫度30、40 ℃和50 ℃時較為穩(wěn)定。最適反應pH值約為5，在pH值為5～6之間相對較穩(wěn)定。Cu2+對酶活力有較強的抑制作用，而Ag+有較強的激活作用。

草酸青霉；β-葡萄糖苷酶；篩選；酶學性質(zhì)

長白山闊葉林（broad-leaved forest）是我國長白山山脈、小興安嶺山脈等溫帶地區(qū)最典型的地帶性森林植物群落，其產(chǎn)生了大量凋落物質(zhì)。凋落物質(zhì)可以增加微生物群落結構多樣性，提高微生物生物量，改善土壤酶活性[1-3]。目前，研究人員主要著重于長白山闊葉林生態(tài)結構、植物群落、土壤及其微生物群落結構和生物量等方面的研究[4-6]，而有關微生物篩選、分離、鑒定和純化及其應用方面的研究報道較少，可見長白山這一菌源寶庫尚未被人們所認知。因此，如何開發(fā)利用這些微生物資源將成為今后研究的主要方向。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，簡稱BG），又名纖維二糖酶，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間糖苷鍵的酶[7]。β-葡萄糖苷酶在食品加工中用于水解糖苷和生氰物質(zhì)等，可以促進風味前體物釋放、苦味和有毒物質(zhì)脫除[8-10]。González-Pombo等[11]將陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）胞外提取純化的β-葡萄糖苷酶用于葡萄酒釀制中，結果顯示酶處理顯著增加了單萜類化合物的數(shù)量，表現(xiàn)出固定化酶在葡萄酒香氣形成中的運用潛能。在飲料加工中，利用β-葡萄糖苷酶對糖苷鍵的作用增加果汁的香氣，可以把苦杏仁苷分解為苯甲醛和氫氰酸以及兩分子葡萄糖[12-13]；β-葡萄糖苷酶對生氰物質(zhì)降解以脫除食品加工原料的毒性[14]。因此，β-葡萄糖苷酶的研究具有重要理論和實用價值。

1837年Wohler等首次在苦杏仁汁中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶后，研究人員先后在柑橘等植物的各組織中發(fā)現(xiàn)此酶[15-17]。從植物中提取β-葡萄糖苷酶成本過高，所以采用發(fā)酵的方法獲得[18]。目前，最有效的β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌是真菌中的曲霉和木霉菌，但這兩類菌株普遍存在酶活力偏低的問題，使降解過程中外切葡聚糖酶和內(nèi)切葡聚糖酶產(chǎn)生的纖維二糖積聚，降低酶解效率[19]。因此，選育具有較強活性的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株就變得極為重要。本研究從長白山闊葉林中篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，不僅可以充分利用長白山這一天然的、豐富的菌源庫，還可以為獲得高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

七葉靈培養(yǎng)基：七葉靈1 g/L、檸檬酸鐵0.5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L；種子培養(yǎng)基：微晶纖維素20 g/L、玉米漿干粉10 g/L、葡萄糖10 g/L，調(diào)pH值至4.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：微晶纖維素33 g/L、玉米漿27 g/L、(NH4)2SO45 g/L、KH2PO46 g/L、MgSO41 g/L、CaCO32.5 g/L、吐溫-80 2 mL/L、甘油2.5 g/L，調(diào)pH值至5.0。

檸檬酸氫二鈉、檸檬酸二氫鈉、氫氧化鈉和鹽酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IFD超凈工作臺 天津億諾科學儀器有限公司；GI54DW高壓滅菌器 上海江萊生物科技有限公司；ZSD-1160生化培養(yǎng)箱 天津東南儀誠科技有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；TC-512梯度PCR儀 北京眾益中和生物技術有限公司；DYY-7C電泳儀 北京市六一儀器廠；CX31+CCD數(shù)字顯微鏡 上海光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌源樣本選擇

選擇吉林省長白山闊葉林帶落葉、腐質(zhì)土壤為篩選β-葡萄糖苷酶菌株的來源。

1.3.2 菌種分離、純化和篩選

稱取5 g樣品于50 mL無菌水中（三角瓶中加入玻璃珠），振蕩混勻20 min。取1 mL懸浮液梯度稀釋，每個梯度取200 μL涂布于馬丁氏平板。取3 個平行，30 ℃恒溫培養(yǎng)約3～5 d。真菌采用10－3～10－6稀釋度，細菌10－4～10－7，放線菌同細菌。將平板上得到的單菌落取出，接于單個PDA平板上；挑取菌落的時候要選擇沒有重疊、單一的菌落。將目的菌株接于七葉靈平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)約3～5 d。將目的菌株接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)5 d，測定酶活力。

1.3.3 發(fā)酵

將目的菌株孢子懸液稀釋至106～107，接取1 mL至種子培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶含有30 mL培養(yǎng)基），28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。將種子培養(yǎng)基中的菌絲體按5%接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 d，離心收集發(fā)酵液，進行酶活力測定。

1.3.4 酶活力測定

向檸檬酸緩沖液中加入1 mL酶液。至少要準備2 個稀釋度的酶液，一個稀釋度在反應條件下釋放略少于1.0 mg的葡萄糖，另一稀釋度則釋放略高于1.0 mg的葡萄糖；加熱至50 ℃，添加1.0 mL的底物溶液，混勻；50 ℃水浴反應30 min；沸水浴加熱5.0 min，終止反應；冷卻，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖的含量。在上述反應條件下，以1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.3.5 形態(tài)鑒定

將菌株點接至新的PDA平板，30 ℃條件下培養(yǎng)，自接種起3 d后拍照，觀察菌落形態(tài)特征。將培養(yǎng)好的菌落用無菌水稀釋，吸取15 μL點至干凈的載玻片上，蓋上蓋玻片，用光學顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。

1.3.6 分子鑒定

將目的菌株接于CM液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)2 d；將CM液體培養(yǎng)基中的菌絲過濾收集，進行基因組DNA提?。徊捎肐TS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4 （5’-TCCTCGCCTTATTGATATGC-3’）引物擴增菌株內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）；采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA，置于凝膠成像系統(tǒng)中，對電泳結果進行分析；回收DNA凝膠，對回收片段進行載體的連接與轉(zhuǎn)化；用同一對引物，進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，凝膠瓊脂糖電泳檢測，驗證目的基因是否丟失。將有目的條帶的菌液送北京奧維森基因科技有限公司測序。測序后將所得序列與GenBank中序列進行BLAST比對。

1.3.7 酶學性質(zhì)測定[20]

1.3.7.1 最適反應溫度測定

用pH 5.0緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶，再與底物分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃條件下反應30 min，測定其酶活力。

1.3.7.2 熱穩(wěn)定性測定

用pH 5.0緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶，分別在30、40、50、60、70、80 ℃條件下保溫10、20、30、40、50、60 min，然后冷卻，將酶液底物在55 ℃條件下反應30 min，測定酶活力。將最高酶活力設為100%，其他條件下酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力。

1.3.7.3 最適反應pH值測定

分別用pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶，再與底物在55 ℃條件下反應30 min，測定其酶活力。

1.3.7.4 pH值穩(wěn)定性測定

用pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶，再與底物分別在55 ℃條件下反應30 min，測定酶活力。將最高酶活力設為100%，其他條件下酶活力與最高酶活力的比值為相對酶活力。

1.3.7.5 金屬離子對酶活力的影響

用1 mmol/L的K+、Na+、Ag+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe3+緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶，再與底物分別在55 ℃條件下反應30 min，測定酶活力，其酶活力與不加金屬離子緩沖液稀釋β-葡萄糖苷酶的比值為相對酶活力。

1.3.7.6 底物特異性

以微晶纖維素、羧甲基纖維素、纖維二糖、水楊苷為底物，將緩沖液稀釋的β-葡萄糖苷酶1 mL與1 mL底物緩沖液在55 ℃反應30 min，加入2.0 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，煮沸5 min后，蒸餾水定容至25 mL，混勻在540 nm波長處測定各管吸光度。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選結果

從長白山闊葉林帶葉子和土壤分離出19 個菌株，將各菌株點種于七葉靈培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)4 d后黑色深淺程度和黑色圓圈直徑大小為作為篩選的標準。在19 個菌株中，1、2、7、8、10和16號菌株在七葉靈平板顯黑色，黑色深淺程度和黑色圓圈直徑大小實驗結果見表1。七葉靈顯色結果表明，篩選出的1、2、7、8、10和16號6 個菌株出現(xiàn)了黑色。其中10號菌株顯色效果最好，七葉靈顯色后的現(xiàn)象見圖1。將初篩得到6 株菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，對生成β-葡萄糖苷酶進行提取和純化，測定β-葡萄糖苷酶酶活力測定的結果見表1。生物傳感分析儀測得10號菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高為18.34 U/mL。

表 11 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株篩選Table 1 Screening of β-glucosidase-producing fungi

圖1 10號菌株在七葉靈培養(yǎng)基上的顯色結果Fig.1 Color development of strain 10 on esculin medium

2.2 形態(tài)鑒定結果

將10號菌株接種于無菌的PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)3 d，觀察其菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)。由圖2a可知，PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，10號菌株即形成較典型的菌落。菌落中間呈藍綠色，邊緣為白色，直徑約20 mm。由圖2b可知，10號菌株的菌絲體細長，孢子個體較大，成串狀分布。

圖2 10號菌株3 d菌落形態(tài)（a）和菌絲孢子形態(tài)（b）（×400）Fig.2 Morphology of bacterial colony of strain 10 (×400)

2.3 測序及序列分析

獲得10號菌株基因組DNA，利用ITS引物在55 ℃退火溫度下，進行PCR反應，經(jīng)35 個循環(huán)后，兩個試樣均得到目的擴增產(chǎn)物，大小650 bp左右，見圖3。

圖3 ITS序列PCR擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of amplifi ed ITS sequence

ITS擴增序列如下：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG TGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGCC CTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACC TTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGG GGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGAC ACACAAACGAACTCTTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGTACTTGACTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAAC GGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCA GTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCC CTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCAT TGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTCTC GCCCCCCGCTTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAG CGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGG CTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCG CCGGCGAACACCATCAATCTTAACCAGGTTGACCT CGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCAT ATCAATAAGCGGAGGAA

圖4 10號菌株驗證載體上目的基因的電泳圖Fig.4 Electrophoresis of target genes from the carrier of strain 10

由圖4可知，經(jīng)DNA凝膠回收、載體的連接與轉(zhuǎn)化、挑斑、PCR擴增后，取10 個樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，10 個樣品在650 bp左右均有條帶，其中泳道2、5、7、8、10的條帶較為清晰，表明載體上的目的基因沒有丟失，可將載體送基因公司測序。測序結果表明，ITS片段長度為615 bp，經(jīng)過在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST比對發(fā)現(xiàn)，菌株與草酸青霉（Penicillium oxalicum）親緣性最為接近，相似度高達100%，因此鑒定10號菌株為草酸青霉。

2.4 酶學性質(zhì)

2.4.1 最適反應溫度

圖5 反應溫度對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the activity of β-glucosidase

由圖5可知，β-葡萄糖苷酶酶活力隨著溫度升高而增加，當反應溫度為55 ℃時，β-葡萄糖苷酶酶活力達到最高值為17.84 U/mL，之后β-葡萄糖苷酶酶活力隨著溫度升高而減小。說明β-葡萄糖苷酶最適反應溫度約為55 ℃。

2.4.2 溫度對酶穩(wěn)定性的影響

圖6 溫度對β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of β-glucosidase

在不同保溫處理條件下，溫度對β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性影響的結果見圖6。在保溫溫度為30、40、50 ℃時，相對酶活力比較穩(wěn)定；在保溫溫度為60 ℃和70 ℃時，相對酶活力隨著保溫時間延長而急劇下降為0。說明在溫度30、40、50 ℃時β-葡萄糖苷酶較為穩(wěn)定。

2.4.3 最適反應pH值

圖7 pHH值對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.7 Effect of pH on the activity of β-glucosidase

由圖7可知，β-葡萄糖苷酶酶活力隨著pH值升高而增加，當pH值為5時，β-葡萄糖苷酶酶活力達到最高值17.01 U/mL，之后β-葡萄糖苷酶酶活力隨著pH值升高而減小。說明β-葡萄糖苷酶最適pH值約為5。

2.4.4 pH值對酶穩(wěn)定性的影響

圖8 pHH值對β-葡萄糖苷酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on the stability of β-glucosidase

在不同pH值反應條件下，pH值對酶穩(wěn)定性影響的結果見圖8。β-葡萄糖苷酶相對酶活力隨著pH值升高而增加，當pH值為5～6時，β-葡萄糖苷酶相對酶活力變化較小，之后相對酶活力隨著pH值升高而急劇減小。說明β-葡萄糖苷酶在pH值為5～6相對較穩(wěn)定。

2.4.5 不同金屬離子對酶活力的影響

圖9 金屬離子對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響Fig.9 Effect of metal ions on the activity of β-glucosidase

由圖9可知，K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+對β-葡萄糖苷酶活力有抑制作用，其中Cu2+抑制作用最明顯，相對酶活力僅為29.62%。Ag+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對β-葡萄糖苷酶活力有激活作用，其中Ag+激活作用最明顯，相對酶活力達到123.23%。

2.4.6 β-葡萄糖苷酶的底物特異性

圖10 β-葡萄糖苷酶的底物特異性Fig.10 Substrate specifi city of β-glucosidase

β-葡萄糖苷酶底物特異性的測定結果見圖10。β-葡萄糖苷酶對微晶纖維素和羧甲基纖維素酶解能力較弱，而對纖維二糖和水楊苷的酶解能力較強。這說明底物種類直接影響β-葡萄糖苷酶酶活力。

3 結論與討論

本研究利用馬丁氏培養(yǎng)基富集、PDA培養(yǎng)基純化和七葉靈顯色技術這一系列方法篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，這些方法綜合應用才能得到確實可靠的結果[21]。其中，七葉靈顯色技術對于產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的識別能力快速有效，通過七葉靈培養(yǎng)基上黑色深淺的程度以及黑色圓圈的直徑，初步篩選出產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌[22]。本研究從菌源地采得樣品中分離得到形態(tài)不同，且生長較快的菌株共19 株，接入七葉靈培養(yǎng)基，篩選出6 株具有黑色圓圈的菌株。將初篩得到的6 株菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，對生成的β-葡萄糖苷酶進行提取和純化，生物傳感分析儀測得10號菌株的β-葡萄糖苷酶活力最高為18.34 U/mL，此菌株產(chǎn)酶的酶活力略高于個別報道[23]。本研究對該菌株進行培養(yǎng)，形成的菌落中間呈藍綠色、邊緣為白色、直徑約20 mm，菌絲體細長、孢子個體較大、成串狀分布，初步鑒定10號菌株為霉菌。

一般來說對菌種的鑒定都是釆用形態(tài)學描述和生理生化特性實驗相結合，但是由于菌株之間存在著形態(tài)的相似和某些生理性質(zhì)的相近，使得菌種鑒定的準確性無法得到保證[24]。本研究釆用形態(tài)鑒定和分子鑒定（ITS序列分析）相結合的方法對10號菌株進行鑒定，消除菌種鑒定時的誤差，確定該菌株為草酸青霉（Penicillium oxalicum），相似度達100%。目前，用來生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的微生物大多為真菌類，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，對草酸青霉的研究相對較少[25]。研究報道表明，草酸青霉是生產(chǎn)纖維素酶和果膠酶的主要菌株之一，該菌株因具有一定的安全性，研究人員用其產(chǎn)生的酶來提高水果出汁率[26-27]。因此，本研究篩選出草酸青霉不僅豐富了產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株資源，還可以擴大草酸青霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在食品領域的應用。

β-葡萄糖苷酶酶活力受溫度、pH值、金屬離子、底物等條件的影響[28]。本研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶最適反應溫度約為55 ℃，在溫度30、40、50 ℃時較為穩(wěn)定；β-葡萄糖苷酶最適反應pH值約為5，在pH值為5～6相對較穩(wěn)定；K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+對β-葡萄糖苷酶活力有抑制作用，其中Cu2+抑制作用最明顯，相對酶活力僅為29.62%。Ag+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對β-葡萄糖苷酶活力有激活作用，其中Ag+激活作用最明顯，相對酶活力達到123.23%；該酶對纖維二糖和水楊苷的水解作用較強。本研究表明，獲得的菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在中溫和偏酸性條件下可以水解低聚糖和糖苷類物質(zhì)。因此，該酶可以應用在食品加工中細胞壁寡糖和纖維素的降解、糖脂的水解、生氰物質(zhì)的脫除以及產(chǎn)品風味的改變方面。

[1] COLEMAN D C. From peds to paradoxes: linkages between soil biota and their infl uences on ecological processes[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(2): 271-289.

[2] GARTNER T B, CARDON Z G. Decomposition dynamics in mixedspecies leafl itter[J]. Oikos, 2004, 104(2): 230-246.

[3] HOORENS B, AERTS R, STROETENGA M. Does initial litter chemistry explain litter mixture effects on decomposition?[J]. Oecologia, 2003, 137(4): 578-586.

[4] 陳法霖, 張凱, 鄭華, 等. PCR-DGGE技術解析針葉和闊葉凋落物混合分解對土壤微生物群落結構的影響[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2011, 17(2): 145-150.

[5] 富宏霖, 王生榮, 韓士杰, 等. 土壤干濕交替對長白山闊葉紅松林土壤微生物活性與區(qū)系的影響[J]. 東北林業(yè)大學學報, 2009, 37(7): 80-81; 86.

[6] 梁宇, 許嘉巍, 胡遠滿, 等. 長白山闊葉紅松林退化生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸作用[J]. 應用生態(tài)學報, 2010, 21(5): 1097-1104.

[7] 謝宇, 尚曉嫻, 曹黎華. 黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶液體培養(yǎng)基研究[J].南昌航空大學學報: 自然科學版, 2007, 21(4): 49-52.

[8] 祝霞, 韓舜愈, 蔣玉梅, 等. 酶解處理對‘貴人香’干白葡萄酒香氣物質(zhì)的影響[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報, 2011, 46(2): 129-134.

[9] 潘利華, 羅建平. β-葡萄糖苷酶的研究及應用進展[J]. 食品科學, 2006, 27(12): 803-807.

[10] 李遠華. β-葡萄糖苷酶的研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報, 2002, 29(4): 421-425.

[11] GONZáLEZ-POMBO P, FARINA L, CARRAU F, et al. A novel extracellular β-glucosidase from Issatchenkia terricola: isolation, immobilization and application for aroma enhancement of white Muscat wine[J]. Process Biochemistry, 2011, 46(1): 385-389.

[12] 王鴻飛, 李和生, 董明敏, 等. 柚皮苷酶對柑橘類果汁脫苦效果的研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報, 2004, 20(6): 174-176.

[13] SU Erzheng, XIA Tao, GAO Liping, et al. Immobilization of β-glucosidase and its aroma-increasing effect on tea beverage[J]. Food and Bioproducts Processing, 2010, 88(2/3): 83-89.

[14] NATA G Z, VALLIER M. Production of a highly glucosetolerant extracellular β-glucosidase by three aspergillus strains[J]. Biotechnology Letters, 1999, 21(3): 219-223.

[15] KRINGS U, BERGER R G. Biotechnological production of fl avours and fragrances[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1998, 49(1): 1-8.

[16] BARBAGALLO R N, PALMERI R, FABIANO S, et al. Characteristic of β-glucosidase from Sicilian blood oranges in relation to anthocyanin degradation[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 41(5): 570-575.

[17] 張卓, 陳曉平. 蕎麥中β-葡萄糖苷酶提取條件的研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 19-21; 28.

[18] 黃琴, 朱婷, 蔣承建, 等. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種的篩選, 鑒定及其酶學特性[J]. 基因組學與應用生物學, 2011, 30(5): 590-595.

[19] 陳靜, 郝偉偉, 王春梅, 等. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌的篩選鑒定、純化及酶學性質(zhì)分析[J]. 食品科學, 2013, 34(5): 191-196.

[20] 付建紅, 任曉源, 范秋霜, 等. 從天山花楸中分離篩選纖維素酶產(chǎn)生菌及其酶學性質(zhì)研究[J]. 食品科學, 2012, 33(23): 228-231.

[21] 趙林果, 孟鵬, 李麗娟, 等. 利用七葉靈顯色技術檢驗和判斷β-葡萄糖苷酶的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(12): 163-162.

[22] EDBERG C E, TREPETA R W, KONTNICK C M, et al. Measurement of active constitutive β-glucosidase (Esculinase) in the presence of sodium desoxycholate[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1985, 21(3): 363-365.

[23] 覃擁靈, 何海燕, 劉園園, 等. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生真菌的篩選鑒定及酶學性質(zhì)研究[J]. 中國釀造, 2012, 31(3): 53-57.

[24] 唐德芳, 裴小瓊, 李曉璐, 等. 黑曲霉β-葡萄糖苷酶的篩選、克隆及表達[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2009, 15(3): 423-426.

[25] PYO Y H, LEE T C, LEE Y C. Enrichment of bioactive isofl avones in soymilk fermented with β-glucosidase-producing lactic acid bacteria[J]. Food Research International, 2005, 38(5): 551-559.

[26] 張名愛, 王寶維, 岳斌, 等. 草酸青霉果膠酶分離純化工藝及酶學性質(zhì)研究[J]. 食品科學, 2013, 34(9): 175-179. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201309036.

[27] 張倩, 王寶維, 張名愛, 等. 鵝源草酸青霉F67產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報, 2009, 40(1): 47-52.

[28] 謝宇, 尚曉嫻, 胡金剛. β-葡萄糖苷酶純化及酶學性質(zhì)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學學報, 2008, 30(3): 521-524.

Screening and Enzymatic Characteristics of β-Glucosidase-Producing Fungus from Broad-Leaved Forest in Changbai Mountain

LIU Huan1, DUAN Wenqiang2, JIN Long1
(1. Research Center of Changbai Mountain Food Engineering, College of Pharmaceutical and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134000, China; 2. Tonghua City Health School, Tonghua 134000, China)

Six β-glucosidase-producing fungi were screened through enrichment culture in martin medium, purifi cation with PDA medium, and color development with an esculin-based chromogenic medium. β-Glucosidase was extracted and purifi ed from the fermentation broth. Strain 10 revealed the highest β-glucosidase activity of 18.34 U/mL. The strain was identifi ed as Penicillium oxalicum by morphological and molecular methods. The β-glucosidase had optimal temperature of 55 ℃ and was stable at 30, 40, and 50 ℃. The enzyme had optimal pH of 5 and could be stable between pH 5 and 6. Ag+could activate the β-glucosidase while Cu2+could inhibit its activity.

Penicillium oxalicum; β-glucosidase; screening; enzymatic characteristics

Q814

A

1002-6630（2015）19-0180-06

10.7506/spkx1002-6630-201519032

2014-11-07

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150101117JC；20130522093JH）；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目（2013494）

劉歡（1981-），女，講師，博士，研究方向為食品發(fā)酵與釀造。E-mail：liuhuan800331@163.com