宮 雪，江 璐，劉 寧，劉延琳,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊 凌 712100）

高產(chǎn)甘油低產(chǎn)H2S葡萄酒優(yōu)良酵母菌株篩選及其釀酒特性

宮 雪1，江 璐1，劉 寧1，劉延琳1,2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊 凌 712100）

為獲得中國本土優(yōu)良酵母，提高葡萄酒感官特性，通過對采自新疆鄯善地區(qū)、寧夏廣夏三基地的40 株野生酵母菌株進行實驗室釀酒實驗，篩選到兩株高產(chǎn)甘油、低產(chǎn)H2S的葡萄酒優(yōu)良酵母菌株H02、E22。分別于2010、2011年連續(xù)2 a對這2 株菌進行了10～20 L酒廠發(fā)酵實驗并研究其釀酒特性。酒樣理化指標結(jié)果符合國家標準GB 15037-2006《葡萄酒》要求，感官品嘗分析結(jié)果與對照商業(yè)酵母V L1、RC212、C2C的差異性不顯著（P＞0.05），感官品質(zhì)相當，篩選出的野生酵母菌株有著優(yōu)良的釀酒特性。

甘油；葡萄酒；酵母菌；篩選；釀酒

甘油是酵母菌酒精發(fā)酵過程中的正常副產(chǎn)物，主要在葡萄汁發(fā)酵初期產(chǎn)生。甘油存在于各類葡萄酒中，在葡萄酒中含量通常為l～15 g/L[1-3]，其甜味閾值為5.2 g/L，是葡萄酒中除水、酒精、CO2以外含量最豐富的成分[4]。甘油具有甜味和黏稠性，由于其甜味和葡萄糖相似[5]，所以葡萄酒中高的甘油含量有利于提高葡萄酒的口感，改善葡萄酒的感官特性，從而顯著影響葡萄酒的質(zhì)量，尤其對提高干、半干葡萄酒的質(zhì)量具有重要意義。硫化氫（H2S）是對葡萄酒風味有重要影響的揮發(fā)性硫化物，在葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母通過硫代謝過程產(chǎn)生痕量的H2S，它的揮發(fā)性很強，具有不愉快的氣味，通常被描述為臭雞蛋味、臭鼬味、大蒜味或洋蔥味[6]。因此，提高葡萄酒中甘油含量、降低H2S含量均有利于提高葡萄酒質(zhì)量。

國內(nèi)外提高葡萄酒中甘油含量的方法主要有改變發(fā)酵條件[7]、熱激法[8-11]、構(gòu)建高產(chǎn)甘油的基因工程菌[12-13]與適應性演化菌種法[14]，另外，還有混合菌種發(fā)酵、改變葡萄汁成分等方法。但這些方法或多或少都存在著一些不足，如熱激法會使葡萄酒中的香氣蒸發(fā)而喪失；轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品飲料中的應用有一定限制且會導致某些發(fā)酵副產(chǎn)物增加，如琥珀酸酯和醋酸酯[15]；混合菌種發(fā)酵導致乙酸等揮發(fā)性副產(chǎn)物的增加，給葡萄酒帶來不愉悅的香氣[16]。去除葡萄酒中H2S的工藝主要有銅沉淀法和惰性氣體去除法，銅沉淀法可能會造成葡萄酒中銅離子超標，因此，必須將其降至國家標準允許范圍內(nèi)；惰性氣體去除法可能會同時帶走其他重要的揮發(fā)性物質(zhì)，從而造成葡萄酒香氣物質(zhì)的損失。

本研究對分離自新疆鄯善地區(qū)、寧夏廣夏三基地的野生釀酒酵母菌株進行實驗室釀酒實驗，從中篩選優(yōu)良酵母菌株，并進一步對優(yōu)選菌株進行10～20 L酒廠發(fā)酵實驗，研究其釀酒特性。從中國本土野生酵母中篩選高產(chǎn)甘油、低產(chǎn)H2S的葡萄酒優(yōu)良酵母，對于提高葡萄酒感官質(zhì)量，釀造具有中國產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒具有重要意義，并為后續(xù)相關(guān)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

新疆鄯善地區(qū)、寧夏廣夏三基地2 個地區(qū)的不同葡萄品種自然發(fā)酵過程中分離的40 株野生酵母菌株，分離源見表1；對照菌株：商業(yè)酵母X16、RC212、VL1、C2C法國Laffort公司；不產(chǎn)H2S釀酒酵母UCD932和高產(chǎn)H2S釀酒酵母UCD819 美國UCDavis大學。

表1 菌株采樣分離記錄Table 1 Details of the isolated strains

1.1.2 試劑

Megazyme甘油檢測試劑盒 英國Megazyme公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：3.25 g 3,5-二硝基水楊酸、2 mol/L氫氧化鈉162.5 mL、22.5 g丙三醇，用蒸餾水定容至500 mL，棕色瓶4 ℃恒溫放置；葡萄酒理化指標檢測試劑的配制和使用參考國家標準GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；Triple M模擬汁的配制參考文獻[17]。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MJ-250B型霉菌培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)用光學器械廠；H2S檢測管 上海豫東電子科技有限公司；普通光學顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高產(chǎn)甘油菌株的篩選

小白玫瑰葡萄除梗破碎取澄清汁，檢測總糖含量為187 g/L，總酸含量為6.3 g/L（以酒石酸計），pH值為2.65。將葡萄汁按500 mL/瓶分裝到滅過菌的容量為1 L三角瓶中，添加20 mg/L SO2。每瓶按5×105CFU/mL（本實驗菌落計數(shù)方法均采用血球計數(shù)板法計數(shù)對數(shù)期培養(yǎng)的菌株數(shù)量）接種量接入小白玫瑰葡萄汁進行擴大培養(yǎng)，每個菌株重復2 次，商業(yè)酵母X16為對照菌株。接種量在較小變化范圍內(nèi)對酵母甘油含量沒有顯著差異變化[18]?？刂茰囟仍?0 ℃條件下進行發(fā)酵，每隔12 h稱量失重（發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化為CO2氣體損失的質(zhì)量），監(jiān)測發(fā)酵進程，以72 h凈失質(zhì)量總和不超過0.5 g作為發(fā)酵終點；發(fā)酵結(jié)束后自然澄清并分離。按GB/T 15038-2006標準檢測每個菌株發(fā)酵酒樣的相關(guān)理化指標，Megazyme甘油檢測試劑盒檢測甘油含量。

1.2.2 低產(chǎn)H2S菌株的篩選

對1.2.1節(jié)中篩選出的高產(chǎn)甘油酵母菌株進一步進行低產(chǎn)H2S特性的相關(guān)研究。取500 mL滅菌三角瓶，向其中注入300 mL經(jīng)過濾除菌的Triple M模擬汁，每瓶按5×105CFU/mL接種量接入模擬葡萄汁活化酵母菌液，用兩孔硅膠冒封好口，其中H2S檢測管通過球形玻璃彎管與發(fā)酵罐內(nèi)部相連，球形玻璃彎管在硅膠冒下方露出2～3 mm，注意要和液面有較大距離，以免在搖床培養(yǎng)時接觸模擬汁，另一孔中插入長不銹鋼注射針頭到發(fā)酵液面以下。將小瓶放入搖床中20 ℃、120 r/min進行培養(yǎng)，DNS法檢測還原糖含量監(jiān)控發(fā)酵[19]，還原糖含量低于2 g/L終止發(fā)酵，測量H2S檢測管的顯色長度[20]。每菌株3 個重復，不產(chǎn)H2S的釀酒酵母UCD932和高產(chǎn)H2S的釀酒酵母UCD819為對照菌株。

1.2.3 優(yōu)選菌釀酒特性研究

將篩選出的高產(chǎn)甘油、低產(chǎn)H2S的優(yōu)選菌在2010、2011年分別在寧夏御馬酒廠、山西戎子及甘肅莫高酒廠進行10～20 L釀造實驗。新鮮釀酒葡萄除梗破碎，分3 次逐次添加亞硫酸，至游離硫含量達到45 mg/L，并添加20 mg/L果膠酶，混勻后，測定葡萄汁的總酸、總糖含量。采用新鮮調(diào)硫的葡萄汁進行菌株活化，將待測菌株以3%投料量加入到適量葡萄汁中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將活化好的待測菌株以106CFU/mL的接種量加入到發(fā)酵罐中，每個待測菌株設(shè)2 個平行。每日分早、中、晚3 次對發(fā)酵罐進行壓帽，并在壓帽后取樣監(jiān)控發(fā)酵液的品溫和比重，比重到0.990～0.996時測定還原糖含量，還原糖含量小于2 g/L時結(jié)束發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后按GB/T 15038-2006檢測酒精體積分數(shù)、還原糖、總酸、揮發(fā)酸及干浸出物，其中總酸以酒石酸含量計，揮發(fā)酸以乙酸含量計。甘油檢測試劑盒測定甘油含量；由于大型發(fā)酵罐不能安裝H2S檢測管裝置，因此，酒樣中H2S的檢測參考GB/T 16489-1996《水質(zhì)硫化物的測定》，采用亞甲基藍分光光度法。

1.2.4 感官品嘗

2010、2011年的小試酒樣由西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院專業(yè)品嘗員組成品嘗小組從外觀、香氣、口感等方面對不同酒樣進行綜合感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)甘油低產(chǎn)H2S優(yōu)良酵母菌株篩選

表2 菌株發(fā)酵酒樣的理化指標Table 2 Physical and chemical indicators of wine fermented by the isolated strains

由表2可知，在供試野生酵母菌株的小白玫瑰葡萄汁發(fā)酵中，酒精體積分數(shù)為8.30%～12.06%；還原糖含量為1.80～47.50 g/L；揮發(fā)酸含量0.257～0.717 g/L低于GB 15037-2006《葡萄酒》規(guī)定的1.2 g/L，甘油含量為0.611～8.409 g/L。結(jié)合菌株發(fā)酵特性和高產(chǎn)甘油特性，將產(chǎn)生酒精體積分數(shù)大于10.00%、還原糖含量小于4.00 g/L、揮發(fā)酸含量低于0.60 g/L，甘油含量高于6.00 g/L（甘油的甜味閾值為5.2 g/L）的菌株判定為高產(chǎn)甘油的優(yōu)良菌株，初步篩選出D06、D08、D10、D20、D21、E01、E02、E15、E18、E22、F12、F18、F23、F60、H02共15 株高產(chǎn)甘油的優(yōu)良野生酵母菌株。

對上述篩選出的高產(chǎn)甘油酵母菌株進一步進行低產(chǎn)H2S特性的相關(guān)研究，在Triple M模擬葡萄汁的發(fā)酵中，各菌株H2S產(chǎn)量見表2。根據(jù)對照高產(chǎn)H2S菌株UCD819 的H2S產(chǎn)量為2.359 μg/mL，將H2S產(chǎn)量低于0.2 μg/mL的菌株定為低產(chǎn)H2S的優(yōu)選菌株，最終篩選出E22、H02為高產(chǎn)甘油低產(chǎn)H2S的優(yōu)選菌株。H2S含量分別為（0.195±0.117）μg/mL和（0.187±0.104）μg/mL；甘油含量分別為（6.769±0.042）g/L和（7.246±0.013）g/L。

2.2 優(yōu)選菌株釀酒特性研究

2.2.1 發(fā)酵特性評價

優(yōu)選菌株2010、2011連續(xù)2 a酒廠小試發(fā)酵實驗各項理化指標檢測結(jié)果見表3。發(fā)現(xiàn)H02、E22的釀酒特性穩(wěn)定，酒樣的酒精體積分數(shù)≥11%，還原糖含量≤4.0 g/L，揮發(fā)酸含量≤1.2 g/L，符合GB 15037-2006中與釀酒微生物相關(guān)的各項指標要求，具有優(yōu)良的發(fā)酵特性；其表現(xiàn)得到廠家的認可，前期的簡單觀察可初步確認優(yōu)選菌的應用推廣潛力，后續(xù)分析尚待進行。

運用SPSS19.0數(shù)理分析統(tǒng)計軟件對優(yōu)選菌和商業(yè)酵母原酒的各項理化指標在α=0.05顯著水平進行t檢驗，分析結(jié)果見表3。

酒精體積分數(shù)與H2S指標中，優(yōu)選菌在2010、2011年赤霞珠和霞多麗中的表現(xiàn)與相應的對照商業(yè)酵母差異性都不顯著，查t檢驗臨界值表得：t（0.05,2）=4.303。由于優(yōu)選菌2010、2011年酒精體積分數(shù)對應的各t值分別為－2.56、－1.79、2.33、－1.00、－2.39、1.41均小于t（0.05,2）= 4.303，及H2S對應的各t值分別為4.24、4.12、－0.45、2.12、－2.83、－1.90均小于t（0.05,2）=4.303，所以優(yōu)選菌在2010、2011年赤霞珠和霞多麗中的表現(xiàn)與相應的對照商業(yè)酵母差異性都不顯著。

甘油和揮發(fā)酸指標，H02在2010年赤霞珠品種中的甘油和揮發(fā)酸含量與商業(yè)酵母RC212的差異性顯著（t=－4.88、－5.43，|t|≥t（0.05,2）=4.303），且甘油和揮發(fā)酸含量都明顯高于商業(yè)酵母RC212；優(yōu)選菌在其他年份及品種中與各自相應的對照商業(yè)酵母均差異性不顯著（|t|＜t（0.05,2）=4.303）。

表3 葡萄原料及葡萄酒理化指標檢測結(jié)果Table 3 Physical and chemical indicators of grape and wine fermented by selected strains

還原糖和干浸出物指標，H02在2011年霞多麗品種中還原糖含量顯著高于VL1（t =－4.32）；H02在御馬產(chǎn)區(qū)2011年霞多麗和2010年赤霞珠中干浸出物含量分別顯著低于對應商業(yè)酵母VL1和RC212（t = 4.33、26.39）。

總酸指標中，H02在2010、2011年赤霞珠及2011年霞多麗中，總酸含量都分別顯著低于對應商業(yè)酵母RC212與VL1（t=15、6.43、5.66）。這可能是由于不同酵母在不同條件下有著不同的增酸或者降酸能力，導致最后酒樣中酸度差異較大。優(yōu)選菌在其他各組中的總酸與相應商業(yè)酵母差異性不顯著（|t|＜t（0.05,2）=4.303）。綜合優(yōu)選菌的各發(fā)酵指標與商業(yè)酵母比較分現(xiàn)，優(yōu)選菌與商業(yè)酵母VL1、RC212、C2C有著相似的優(yōu)良發(fā)酵特性。

2.2.2 感官特性評價

表4 葡萄酒感官品嘗結(jié)果Table 4 Sensory evaluation of wine fermented by selected strains

品嘗員對不同酒樣的感官評價平均得分見表4。運用SPSS19.0數(shù)理分析統(tǒng)計軟件對優(yōu)選菌和商業(yè)酵母原酒品嘗員得分在0.05顯著水平進行t檢驗，查t檢驗臨界值表得：t（0.05,10）=2.228。分析比較發(fā)現(xiàn)，各優(yōu)選菌與商業(yè)酵母酒樣之間感官特性均差異性不顯著（|t|＜t（0.05,10）= 2.228），且H02的2010赤霞珠、霞多麗與E22的2010赤霞珠與2011霞多麗的感官得分要分別高于對應商業(yè)酵母RC212、VL1和C2C。由此得出結(jié)論，優(yōu)選菌株與商業(yè)酵母VL1、RC212、C2C在霞多麗、赤霞珠中的表現(xiàn)差異不顯著，感官品質(zhì)相當，即具有類似于商業(yè)酵母的優(yōu)良釀酒特性，具有發(fā)展成為商業(yè)酵母的潛在能力。

3 結(jié) 論

通過實驗室釀造實驗和菌株篩選，共獲得2 株高產(chǎn)甘油且低產(chǎn)H2S的葡萄酒優(yōu)良野生酵母菌株，分別為H02、E22，在實驗室釀造實驗中其甘油與H2S含量分別為（7.246±0.013）、（6.769±0.042）g/L與（0.187±0.104）、（0.195±0.117）μg/mL，甘油含量均高于閾值5.2 g/L，H2S含量均低于0.2 μg/mL。

在2010、2011年寧夏御馬酒廠、山西戎子及甘肅莫高酒廠的小試發(fā)酵實驗中，通過t檢驗分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選菌株與商業(yè)酵母VL1、RC212、C2C有著相似的優(yōu)良發(fā)酵特性，且發(fā)酵酒樣都符合中華人民共和國國家標準：GB 15037-2006規(guī)定的要求，優(yōu)選菌具有甘油產(chǎn)量高、H2S產(chǎn)量低的特點且發(fā)酵特性良好，其表現(xiàn)得到廠家的認可。酒樣綜合感官評價的t檢驗分析結(jié)果顯示，優(yōu)選菌的感官評價結(jié)果和各自對應商業(yè)酵母VL1、RC212、C2C差異均不顯著，感官品質(zhì)相當，具有發(fā)展成為商業(yè)酵母的潛在能力。

[1] RANKINE B, BRIDSON D A. Glycerol in Australian wines and factors infl uencing its formation[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1971, 22(1): 6-12.

[2] OUGH C, FONG D, AMERINE M. Glycerol in wine: determination and some factors affecting[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1972, 23(1): 1-5.

[3] 薛軍俠, 徐艷文, 裴穎芳, 等. 葡萄酒中酵母菌高產(chǎn)甘油的研究進展[J].微生物學雜志, 2008, 28(5): 77-82.

[4] 朱濟義, 杜金華, 王秀菊, 等. 葡萄酒中甘油的生成及其影響因素[J].釀酒, 2010, 37(2): 23-26.

[5] RIBEREAU-GAYON J, PEYNAUD E, GUIMBERTEAU G. Formation des produils secondaires de la fermentation alcoolique en lonction de l’alimentation azotée des levures[J]. Comptes Rendus de Academie des Sciences (Paris), 1959, 248: 749.

[6] BOULTON R, SINGLETON V, BISSON L, et al. Principles and practices of winemaking[M]. New York: Chapman Hall, 1995, 166-168.

[7] DU Gang, ZHAN Jicheng, LI Jingyuan, et al. Effect of fermentation temperature and culture medium on glycerol and ethanol during wine fermentation[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2012, 63(1): 132-138.

[8] OMORI T, OGAWA K, UMEMOTO Y, et al. Enhancement of glycerol production by brewing yeast (Saccharomyces cerevisiae) with heat shock treatment[J]. Journal of Fermetation and Bioengineering 1996, 82(2): 187-190.

[9] OMORI T, OGAWA K, KAJIWARA Y, et al. A novel method for screening high glycerol- and ester-producing brewing yeasts (Saccharomyces cerevisiae) by heat shock treatment[J]. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1997, 83(1): 64-69.

[10] BEROVIC M, HERGA M. Heat shock on Saccharomyces cerevisiae inoculum increases glycerol production in wine fermentation[J]. Biotechnology Letters, 2007, 29(6): 891-894.

[11] BERLOT M, BEROVIC M. Saccharomyces cerevisiae inoculum heat shock treatment-new method for enhanced glycerol production in wine[J]. Chemical and Biochemical Engineering Quarterly, 2011, 25(2): 241-245.

[12] 劉桂香, 余秉琦, 諸葛斌, 等. 釀酒酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶的兩個同工酶[J]. 微生物學通報, 2003, 30(5): 106-110.

[13] 趙有璽, 饒志明, 沈微, 等. 產(chǎn)甘油假絲酵母產(chǎn)甘油關(guān)鍵酶基因在釀酒酵母中的表達[J]. 中國生物工程雜志, 2006, 26(1): 38-41.

[14] KUTYNA D R, VARELA C, STANLEY G A, et al. Adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae to generate strains with enhanced glycerol production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93(3): 1175-1184.

[15] REMIZE F, ROUSTAN J, SABLAYROLLES J, et al. Glycerol overproduction by engineered Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains leads to substantial changes in by-product formation and to a stimulation of fermentation rate in stationary phase[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(1): 143-149.

[16] ANDORRA I, BERRADRE M, ROZES N, et al. Effect of pure and mixed cultures of the main wine yeast species on grape must fermentations[J]. European Food Research and Technology, 2010, 231(2): 215-224.

[17] SPIROPOULOS A, TANAKA J, FLERIANOS I, et al. Characterization of hydrogen sulfide formation in commercial and natural wine isolates of Saccharomyces[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2000, 51(3): 233-248.

[18] RADLER F, SCHTITZ H. Glycerol production of various strains of Saccharomyces[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 1982, 33(1): 36-40.

[19] 王春曉, 劉延琳. 釀酒酵母菌株發(fā)酵過程中硫化氫產(chǎn)率動態(tài)變化研究[J]. 釀酒科技, 2012(10): 43-45.

[20] PARK S K. Development of a method to measure hydrogen sulfide in wine fermentation[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 18(9): 1550-1554.

Screening and Evaluation of Yeast Strains for Producing Wine Higher in Glycerol and Lower in Hydrogen Sulphide

GONG Xue1, JIANG Lu1, LIU Ning1, LIU Yanlin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture, Yangling 712100, China)

In order to screen excellent yeast strains for improving the sensory quality of wine, 40 wild yeast strains were isolated from naturally fermented grapes grown in Xinjiang and Ningxia autonomous regions for laboratory-scale wine fermentation. H02 and E22 strains were screened as excellent strains for producing high-glycerol, low-hydrogen sulphide wine. Fermentation experiments for laboratory-scale production of wine (10 - 20 L) were conducted using the two strains in 2010 and 2011, respectively, for investigating their fermentation characteristics. The physical and chemical indexes of the resulting wines met the requirements of the Chinese national standard GB 15037-2006 for wine. In terms of sensory evaluation, there was no signifi cant difference (P ＞ 0.05) between the two strains and commercial yeasts VL1, RC212 and C2C. These results indicate that the screened strains have excellent fermentation characteristics for wine production.

glycerol; grape wine; yeast; screen; wine-brewing

TS261.1

A

1002-6630（2015）19-0132-05

10.7506/spkx1002-6630-201519023

2013-11-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（葡萄）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-30-jg-3）

宮雪（1988-），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒分析檢測及釀酒微生物。E-mail：gongxue@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：劉延琳（1966-），女，教授，博士，研究方向為葡萄-葡萄酒及釀酒微生物。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn