秦丹丹 任野平

·臨床研究與應(yīng)用·

miRNA-30a在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用

秦丹丹 任野平

目的：探討微小RNA（miRNA）-30a在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)及其臨床意義。方法：收集95例2006年4月至2011年3月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治患者，從獲取的新鮮腎細(xì)胞癌組織和對(duì)應(yīng)的正常對(duì)照組織樣本以及腎癌細(xì)胞系中分別提取總RNA，應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)miRNA-30a表達(dá)水平，并分析miRNA-30a與臨床病理資料和預(yù)后的關(guān)系。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)可能的靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。利用MTT法驗(yàn)證miRNA-30a對(duì)細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果：miRNA-30a在腎癌組織中表達(dá)水平顯著低于正常腎組織（P＜0.01），在腎癌細(xì)胞系中表達(dá)低于正常腎上皮細(xì)胞。miRNA-30a可抑制腎癌細(xì)胞的增殖。生物信息學(xué)方法和qRT-PCR表明，異黏蛋白（MTDH）為miRNA-30a靶基因。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-30a高表達(dá)的腎癌患者總生存期優(yōu)于低表達(dá)者（P＜0.01）。結(jié)論：miRNA-30a在腎癌中低表達(dá)，miRNA-30a低表達(dá)與腎癌不良預(yù)后有關(guān)，并且miRNA-30a可通過MTDH抑制腎癌細(xì)胞的增殖。

腎細(xì)胞癌 miRNA-30a 增殖 預(yù)后 異黏蛋白

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是腎臟常見的一種惡性腫瘤，占全身腫瘤3%，且近20年腎細(xì)胞癌的發(fā)病率有所升高［1］。腎癌主要治療方法為手術(shù)，但約30%患者術(shù)后3年內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)，其5年生存率低于10%，另外約25%患者確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移［2］。因此，尋找一種可靠的生物學(xué)標(biāo)記物，能對(duì)腎細(xì)胞癌進(jìn)行早期診斷并能判斷患者預(yù)后以及指導(dǎo)個(gè)體化治療具有重要的意義。miRNA可通過影響腫瘤的增殖、遷移、侵襲等環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的作用。microRNA（miRNA）是一種長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，主要功能是負(fù)性

調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。自1993年以來，迄今為止發(fā)現(xiàn)的miRNA已超過1 000種。成熟的miRNA可與相關(guān)蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC進(jìn)一步與靶基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR3）結(jié)合，對(duì)mRNA的穩(wěn)定性或翻譯進(jìn)行抑制。本研究檢測(cè)腎癌組織中miRNA-30a表達(dá)，分析其與臨床病理之間的關(guān)系，并初步檢測(cè)miRNA-30a對(duì)腎癌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2006年4月至2011年3月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治腎細(xì)胞癌患者95例，男性34例，女性61例，中位年齡60（38～84）歲，均接受手術(shù)治療。癌灶中央部位組織和作為對(duì)照的對(duì)應(yīng)癌旁正常組織均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前未行放化療或其他治療。切除標(biāo)本后，立即將組織儲(chǔ)存于液氮中，存于-80℃，待用。腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株ACHN、Caki-1、Caki-2、786-0、A498、Ketr-3以及正常人腎臟細(xì)胞HK-2均購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心（ATCC）。細(xì)胞使用含1%鏈霉素-氨芐青霉素、10%胎牛血清的DMEM，并在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）試劑盒均購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 Caki-1和Caki-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miRNA-30a類似物/類似物對(duì)照物（NC）和miRNA-30a抑制劑/抑制劑對(duì)照物購(gòu)自上海吉瑪公司。根據(jù)Lipofectamine 2000使用說明，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞RNA核蛋白以行qRT-PCR和Western blot。

1.2.2 RNA提取和qRT-PCR檢測(cè) 按照試劑使用說明，使用Trizol提取細(xì)胞或組織總RNA。使用U6作為miRNA定量的內(nèi)參。采用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qRT-PCR，對(duì)RNA進(jìn)行定量。β-actin作為mRNA定量的內(nèi)參。所用引物如下：miRNA-30a上游引物為5'-GCCTGTAAACATCCTCGACTGGAAG-3'，下游引物為5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；異黏蛋白（metadherin，MTDH）上游引物為5'-ATCACAGTTA CCACCGAGCA-3'，下游引物為5'-CTTCTCCTCACC TGCACTGA-3'。miRNA表達(dá)水平以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt= ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行miR?NA-30a類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染，24 h后將細(xì)胞消化后行細(xì)胞計(jì)數(shù)。96孔板鋪板細(xì)胞密度為7.5×103/mL，每組6個(gè)復(fù)孔，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)檢測(cè)4天。從鋪板后第2天開始，加入10 μL/孔MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入150 μL/孔二甲基亞砜（DMSO）終止反應(yīng)。檢測(cè)490 nm處吸光值。

1.2.4 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)靶基因 使用miRNABase，TargetScan，PicTar和miRNAanda方法預(yù)測(cè)miRNA-30a可能的靶基因與結(jié)合位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析組織中miRNA-30a表達(dá)差異。采用χ2檢驗(yàn)分析miRNA-30a表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間關(guān)系，Kaplan-Meier和Log rank方法分析miRNA-30a表達(dá)與患者生存率關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-30a在癌組織和腎癌細(xì)胞系中表達(dá)

qRT-PCR分析結(jié)果顯示，miRNA-30a在大部分腎癌組織中表達(dá)顯著降低（圖1A），miRNA-30a表達(dá)在腎癌細(xì)胞系中低于非癌細(xì)胞系，兩者比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B）。

2.2 miRNA-30a與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

為明確miRNA-30a在腎癌中的作用，進(jìn)行miRNA-30a表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的分析。結(jié)果顯示，miRNA-30a表達(dá)水平與患者性別、腫瘤分化水平、腫瘤大?。ㄒ阅[瘤長(zhǎng)徑與短徑乘積表示大小、選取中位數(shù)為界值分組）以及病理類型無明顯相關(guān)性（P＞0.05），miRNA-30a與腫瘤的分期呈負(fù)相關(guān)。表明miRNA-30a可能具有抑制腎癌的作用（表1）。

2.3 miRNA-30a表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系

腎癌患者miRNA-30a表達(dá)水平以ΔΔCt=0.70為界分為高表達(dá)和低表達(dá)。Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-30a高表達(dá)患者預(yù)后明顯較好，高、低表達(dá)的中位生存期分別為41（12～60）、52（15～60）個(gè)月（P=0.006，圖2）。

圖1 miRNA-30a在癌組織和腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)Figure 1 miRNA-30aexpressioninrenalcancertissuesandcelllines

表1 miRNA-30a與95例患者臨床病理的關(guān)系Table 1 Correlation between the clinicopathological characteristics and miRNA-30aexpressionin 95patients

2.4 miRNA-30a對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的作用

分別對(duì)miRNA-30a低表達(dá)的Caki-1細(xì)胞、高表達(dá)的Caki-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30a類似物/類似物對(duì)照物或miRNA-30a抑制劑/抑制劑對(duì)照物24 h后，行miRNA-30a表達(dá)定量分析（圖3A）。使用MTT法檢測(cè)miRNA-30a對(duì)細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果表明miRNA-30a過表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖，抑制miRNA-30a后可促進(jìn)細(xì)胞的增殖（圖3B，3C）。

2.5 MTDH與miRNA-30a靶向關(guān)系

使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA-30a可能的靶基因，對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行篩選，得到與腫瘤關(guān)系較密切的靶基因，本研究選定MTDH作為研究對(duì)象。MTDH與miRNA-30a結(jié)合位點(diǎn)具有物種保守性（圖4A斜體部分）。在腎癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-30a類似物后，MTDH表達(dá)被抑制，而轉(zhuǎn)染miRNA-30a抑制劑后MTDH表達(dá)上調(diào)（圖4B），MTDH與miRNA-30a具有靶向關(guān)系。

圖2 miRNA-30a與腎癌患者預(yù)后Figure 2 miRNA-30aexpressionandprognosisinrenalcancerpatients

圖3 miRNA-30a對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的作用Figure 3 EffectofmiR-30aonrenalcancercellproliferation

Hsa 5'AUGGUUUAGUUUACAAUUUUUAAAAAG 3'

Mml 5'AUGGUUUAGUUUACAAUUUUUAAAAAG 3'

Rno 5'UUGGUUUAGUUUACAGUUCUUUAAAAG 3'

Cfa 5'CUGGUUUAGUUUACAGUUUUUAAAAAG 3'

Ptr 5'AUGGUUUAGUUUACAAUUUUUAAAAAG 3'

Mmu 5'UUGGUUUAGUUUACAGUUCUUUAAAAG 3'A

圖4 MTDH與miRNA-30a靶向關(guān)系Figure 4 Relationship between the MTDH and the miRNA-30a target gene

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，miRNA在惡性腫瘤中表達(dá)異常，表明miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可以發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用［3］。研究表明，miRNA-30a在乳腺、肝臟、肺臟、消化系統(tǒng)多種腫瘤中都起著重要作用［4-7］。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a在腎癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，腎癌的分期與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miRNA-30a高表達(dá)的腎癌患者的預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)者。腫瘤的分化程度雖與病理類型以及腫瘤的惡性程度相關(guān)，但本研究中miRNA-30a與腫瘤的分化程度和病理類型無明顯相關(guān)性，這可能與miRNA的組織特異性相關(guān)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中常常發(fā)生染色體的失衡，包括染色體擴(kuò)增、缺失或表觀遺傳學(xué)的變化。miRNA-30a位于染色體6q13，有研究表明在某些癌癥中由于雜合性丟失會(huì)導(dǎo)致其成為基因組脆性區(qū)域［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-30a在腎癌中表達(dá)下降，與上述的研究結(jié)果一致。

在多種腫瘤中進(jìn)行了miR-30家族成員研究，雖然miR-30家族5個(gè)成員之間序列高度相同，但行使的功能卻有差別。有研究表明，在黑色素瘤中miRNA-30b/d可增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力，從而發(fā)揮癌基因的作用［9］。miR-30e與miR-30b/d的種子序列雖相同，但與之相反的是在乳腺癌中miR-30e可發(fā)揮抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用［10］。Baraniskin等［11］研究表明，miRNA-30a可通過靶向DTL（denticleless protein homolog）抑制結(jié)腸癌的增殖。這些研究表明，miRNA功能的行使可能與其靶標(biāo)有關(guān)，而且在不同類型的組織和細(xì)胞中，miRNA行使的功能也不同。

MTDH在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用。MTDH基因位于染色體8q22上，在乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種腫瘤中高表達(dá)并且與不良預(yù)后相關(guān)［12］。MTDH介導(dǎo)了多種形式的化療抵抗，有研究表明下調(diào)MTDH表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑、多柔比星等藥物介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［13］。MTDH可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，通過NF-κB途徑增加相關(guān)黏附分子的表達(dá)，MTDH是Ha-ras下游基因，Ha-ras通過P13K/AKT/GSK3B/c-Myc途徑誘導(dǎo)MTDH大量表達(dá)［14］。尚有實(shí)驗(yàn)表明，在乳腺癌中miRNA-30a可通過MTDH實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用［15］。本研究表明miRNA-30a對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的抑制作用可能是通過靶向MTDH實(shí)現(xiàn)的。

總之，本研究結(jié)果初步表明miRNA-30a可抑制腎癌的增殖，并且可改善腎癌患者的預(yù)后，應(yīng)在轉(zhuǎn)移和侵襲方面繼續(xù)探討miRNA-30a的作用。另外，基于miRNA家族成員之間發(fā)揮功能不同的特點(diǎn)，有必要研究miRNA家族所有成員在腎癌中的作用。在不久的將來miRNA-30a可能作為潛在的治療靶點(diǎn)。

[1] Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2] Xiao H,Zeng J,Li H,et al.MiR-1 downregulation correlates with poor survival in clear cell renal cell carcinoma where it interferes with cell cycle regulation and metastasis[J].Oncotarget,2015,6(15):13201-13215.

[3] Servin-González LS,Granados-López AJ,López JA.Families of microRNAs expressed in clusters regulate cell signaling in cervi?cal cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(6):12773-12790.

[4] D'Aiuto F,Callari M,Dugo M,et al.Mir-30e*is an independent subtype-specific prognostic marker in breast cancer[J].Br J Can?cer,2015[Epub ahead of print].

[5] Zhou JN,Zeng Q,Wang HY,et al.MiR-125b attenuates epitheli?al-mesenchymal transitions and targets stem-like liver cancer cells through SMAD2 and SMAD4[J].Hepatology,2015[Epub ahead of print].

[6] Sachdeva M,Whitley MJ,Mito JK,et al.MicroRNA-16 suppress?es metastasis in an orthotopic,but not autochthonous,mouse model of soft tissue sarcoma[J].Dis Model Mech,2015[Epub ahead of print].

[7] Ishimoto T,Baba H,Izumi D,et al.Current perspectives towards the identification of key players in gastric cancer microRNA dys?regulation[J].Int J Cancer,2015[Epub ahead of print].

[8] Noviello C,Courjal F,Theillet C.Loss of heterozygosity on the long arm of chromosome 6 in breast cancer:possibly four regionsof deletion[J].Clin Cancer Res,1996,2(9):1601-1606.

[9] Gaziel-Sovran A,Segura MF,Di Micco R,et al.miR-30b/30d regulation of GaINAc transferases enhances invasion and immu?nosuppression during metastasis[J].Cancer Cell,2011,20(1):104-118.

[10]Wu F,Zhu S,Ding Y,et al.MicroRNA-mediated regulation of Ubc9 expression in cancer cells[J].Clin Cancer Res,2009,15(5): 1550-1557.

[11]Baraniskin A,Birkenkamp-Demtroder K,Maghnouj A,et al. MiR-30a-5p suppresses tumor growth in colon carcinoma by targeting DTL[J].Carcinogenesis,2012,33(4):732-739.

[12]Li J,Zhang N,Song LB,et al.Astrocyte elevated gene-1 is a nov?el prognostic marker for breast cancer progression and overall pa?tient survival[J].Clin Cancer Res,2008,14(11):3319-3326.

[13]Hu G,Wei Y,Kang Y.The multifaceted role of MTDH/AEG-1 in cancer progression[J].Clin Cancer Res,2009,15(18):5615-5620.

[14]Yoo BK,Emdad L,Lee SG,et al.Astrocyte elevated gene-1 (AEG-1):A multifunctional regulator of normal and abnormal physiology[J].Pharmacol Ther,2011,130(1):1-8.

[15]Zhang N,Wang X,Huo Q,et al.MicroRNA-30a suppresses breast tumor growth and metastasis by targeting metadherin[J]. Oncogene,2014,33(24):3119-3128.

（2015-02-05收稿）

（2015-06-23修回）

秦丹丹 專業(yè)方向?yàn)槔钳從I，腎腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：qindandan1989@126.com

IARC發(fā)布乳腺癌篩查指南

2014年11月，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究署（WHO/IARC）在法國(guó)里昂召集了16個(gè)國(guó)家的25位專家，對(duì)現(xiàn)有的乳腺癌篩查技術(shù)與方案的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)估，重新制定乳腺癌篩查手冊(cè)，為世界各國(guó)開展乳腺癌篩查提供指導(dǎo)性意見，所形成的共識(shí)于6月3日在線發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（N Engl J Med）。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院?jiǎn)逃蚜纸淌?、《中?guó)腫瘤臨床》編委是唯一參加該篩查手冊(cè)制定的中國(guó)專家。

指導(dǎo)意見進(jìn)一步肯定了鉬靶作為乳腺癌篩查方法的有效性，大量數(shù)據(jù)表明鉬靶篩查可明顯降低50～69歲女性死亡率，對(duì)于70～74歲女性的死亡率也有顯著降低，但是對(duì)于40～49歲女性，現(xiàn)存證據(jù)有限。該報(bào)告同時(shí)指出篩查帶來的風(fēng)險(xiǎn)如過度診斷、短期負(fù)面心理影響和檢查所產(chǎn)生的射線對(duì)乳腺癌發(fā)病率的影響，但考慮到篩查收益顯著大于射線產(chǎn)生的危害，IARC強(qiáng)烈建議對(duì)50～69歲女性開展有組織的定期鉬靶篩查，但現(xiàn)有證據(jù)仍無法確定最佳篩查間隔。

其他影像學(xué)方法及乳腺臨床檢查和自檢的評(píng)估指導(dǎo)意見指出，超聲作為鉬靶的輔助篩查技術(shù)在致密性乳房的女性中可提高鉬靶陰性結(jié)果中的乳腺癌檢出率，但也增加假陽性概率。值得注意的是，目前基于超聲的研究全部來自于觀察性研究，尚無高質(zhì)量、設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那罢靶耘R床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，無法評(píng)估其是否可降低人群乳腺癌死亡率。與超聲相似，臨床手診也缺少前瞻性臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，難以評(píng)估其對(duì)死亡率的影響?，F(xiàn)有證據(jù)僅表明，相比未篩查組，臨床手診組檢出的乳腺癌病灶更小，腫瘤分期更早。對(duì)于其他影像學(xué)檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)有數(shù)據(jù)僅發(fā)現(xiàn)斷層成像技術(shù)輔助鉬靶篩查可顯著提高原位癌和浸潤(rùn)性乳腺癌檢出率，但對(duì)人群死亡率的影響證據(jù)尚不充分。高危人群中多種篩查技術(shù)聯(lián)合方案，如核磁共振輔助鉬靶/超聲等有效性尚待研究證實(shí)。

——引自“醫(yī)學(xué)論壇網(wǎng)”網(wǎng)站

miRNA-30a expression in renal cell carcinoma and its effect on renal cancer cells

Dandan QIN,Yeping REN
Department of Nephrology,The 2ndAffiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150086,China.

Yeping REN;E-mail:renyeping0123@126.com

Objective:To investigate the expression and clinical significance of microRNA-30a in renal cell carcinoma(RCC). Methods:The miRNA-30a expression in renal tissues and cell lines was detected using quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR),and the relationship between miRNA-30a expression and the clinicopathological features of RCC was analyzed.The effect of miRNA-30a on cancer cells was evaluated using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay.In addition,a bioinformatics algorithm was adopted to predict the potential targets of miRNA-30a.Results:miRNA-30a was downregulated both in RCC tissues and cell lines.Patients with higher miRNA-30a expression exhibited better prognosis than those with lower miRNA-30a expression.Bioinformatics algorithm and qRT-PCR both indicated that metadherin(MTDH)was a target of miRNA-30a.Moreover,MTT results showed that miRNA-30a could inhibit cell proliferation.Conclusion:miRNA-30a was inhibited in renal cancer,and low miRNA-30a expression was associated with poor prognosis.In addition,miRNA-30a could inhibit the growth of cells through MTDH.

renal cell cancer,miRNA-30a,proliferation,prognosis,MTDH

10.3969/j.issn.1000-8179.20150182

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)一科（哈爾濱市150086）

任野平 renyeping0123@126.com