陸 俊，曹龍龍，黃昌明，鄭朝輝，李 平，謝建偉

近十年來，盡管全球胃癌的發(fā)病率呈逐年下降趨勢(shì)，但是胃癌仍是目前世界上第四大常見的惡性腫瘤和最常見的消化道惡性腫瘤之一，而且高居全球癌癥相關(guān)死因第二位，嚴(yán)重危害人類的健康安全[1－2]。盡管胃癌的根治性手術(shù)、術(shù)前化療、術(shù)后輔助化療和同步放療等綜合治療手段不斷進(jìn)步，但仍無法獲得滿意療效，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者的主要死亡原因。因此，積極探索胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的防治靶點(diǎn)，進(jìn)一步制定新的有效的干預(yù)策略，對(duì)提高胃癌患者長(zhǎng)期生存率具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。

Ezrin蛋白是 ERM（Ezrin－Radimn－Moesin）家族的重要成員之一，是一種膜－細(xì)胞骨架鏈接蛋白，對(duì)細(xì)胞粘附、形態(tài)、分化、運(yùn)動(dòng)等起重要調(diào)節(jié)作用。近來研究顯示，Ezrin蛋白對(duì)惡性腫瘤的預(yù)后價(jià)值仍未達(dá)成共識(shí)。Wang等報(bào)道，在結(jié)腸癌患者中，Ezrin蛋白高表達(dá)則預(yù)示患者預(yù)后不良[3]。Moilanen等則認(rèn)為，對(duì)于卵巢漿液性囊腺癌的患者，Ezrin蛋白表達(dá)越低，其預(yù)后越差[4]。目前，Ezrin蛋白對(duì)胃癌生物學(xué)行為的改變以及對(duì)胃癌患者預(yù)后影響的研究少見報(bào)道。因此，本研究旨在通過檢測(cè)Ezrin在胃癌中的表達(dá)情況，分析Ezrin與胃癌增殖侵襲及與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性，初步探討Ezrin蛋白在胃癌增殖侵襲過程中的作用機(jī)制，以期為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后判斷及臨床治療提供新的思路和依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2006年10月－2007年9月存檔的石蠟包埋標(biāo)本294例，男性209例，女性85例，年齡中位數(shù)60歲（22～88歲）。無腹膜轉(zhuǎn)移的胃癌組織206例，腹膜轉(zhuǎn)移癌組織34例，癌旁組織54例。另外收集2012年5－6月手術(shù)的16例胃癌患者的新鮮胃癌組織及其鄰近的癌旁組織，男性11例，女性5例，年齡中位數(shù)57歲（31～76歲）?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療，均施行胃癌D2根治術(shù)，術(shù)后標(biāo)本均由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師檢查，病理診斷無誤。手術(shù)方法及術(shù)后病理組織學(xué)分型均按日本胃癌協(xié)會(huì)《胃癌處理規(guī)約》規(guī)定施行，并按第7版UICCTNM分期標(biāo)準(zhǔn)予以TNM 分期[5－6]。全組191例患者獲得隨訪，隨訪率為92.7%，隨訪時(shí)間中位數(shù)51.5月（3～70月）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué) 采用二步法免疫染色方法。主要步驟如下：石蠟包埋胃癌組織，經(jīng)4μm連續(xù)切片，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，65℃烘干3h。經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，通過高壓法修復(fù)抗原。去離子水孵育10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。添加一抗（兔抗人Ezrin多克隆抗體工作濃度1∶500），4℃過夜。添加試劑1（增強(qiáng)劑），37℃孵育20min；添加試劑2（二抗），37℃孵育30min；DAB溶液顯色。最后經(jīng)蘇木素復(fù)染后，用中性樹膠封片。染色結(jié)果判斷按腫瘤細(xì)胞陽性率和著色強(qiáng)度分別進(jìn)行記分，兩者記分乘積：0～3分為弱表達(dá)組，≥4分為強(qiáng)表達(dá)組。

1.2.2 Western－blot檢測(cè) 采用免疫印跡法檢測(cè)新鮮胃癌標(biāo)本中Ezrin蛋白的表達(dá)量。具體步驟如下：將胃癌組織置于液氮中（或培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞置于勻漿器中）充分研磨，離心后收集上清液為組織蛋白抽提物，存放于－20℃冰箱。對(duì)組織蛋白進(jìn)行BCA法蛋白定量檢測(cè)。取含有50μg蛋白的樣品加入適當(dāng)?shù)纳蠘泳彌_液，將含蛋白的上樣緩沖液加入凝膠中，設(shè)定100V電壓行電泳，設(shè)定電壓100V，電流300mA，恒流，冰浴下轉(zhuǎn)膜90min。采用脫脂奶粉封閉非特異性免疫反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)，加一抗（Ezrin濃度1∶800；GAPDH 濃度1∶1 000），脫色搖床上4℃孵育過夜。加入1∶500的用封閉液稀釋的相應(yīng)的二抗，室溫緩慢振搖90min，加ECL發(fā)光底物，最后曝光、密度掃描和半定量分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將凍存 MKN－45胃癌細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，加入10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔5×104接種細(xì)胞，鋪一塊六孔板。取5.0μL的siRNA溶于200μL opti－MEM中，標(biāo)記為A管；將5μL lipo2000加入200μL opti－MEM 中，標(biāo)記為B管；將A管和B管混合后分別加入各孔中，轉(zhuǎn)染4h后每孔加入2mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，最終獲得下調(diào)Ezrin蛋白的細(xì)胞系E－SH1和E－SH2。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 采用 MTT溶液（5mg／mL）處理siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)組及未處理的對(duì)照組，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下孵育4h，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔細(xì)胞吸光度，以時(shí)間為橫軸、各孔細(xì)胞吸光度為縱軸繪制時(shí)間曲線。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞及未處理的對(duì)照組細(xì)胞等量加入Transwell小室中，小室內(nèi)用無血清培養(yǎng)基，24孔板內(nèi)加入含20%血清的培養(yǎng)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下培養(yǎng)24h。通過固定及染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖均使用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 17.0軟件包。計(jì)量資料用±s表示，采用非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或者Fisher確切概率法；單因素生存分析采用Kaplan－Meier方法和Log－rank檢驗(yàn)；多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析。P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Ezrin蛋白在胃癌組織、癌旁組織及腹膜轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá) 在正常胃黏膜組織中，Ezrin蛋白表達(dá)率低，大多數(shù)為陰性或弱陽性表達(dá)；在胃癌組織及腹膜轉(zhuǎn)移灶癌組織中，Ezrin蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)率明顯升高（圖1），Ezrin蛋白在胃癌組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為53.9%（111／206），弱陽性表達(dá)率為46.1%（95／206）；在癌旁組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為31.5%（17／54），弱陽性表達(dá)率為68.5%（37／54），兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝8.591，P＜0.05）；Ezrin蛋白在腹膜轉(zhuǎn)移灶癌組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率為70.6%（24／34），弱陽性表達(dá)率為29.4%（10／34），與原發(fā)灶癌組織相比，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.587，P＜0.05）。

2.2 Ezrin蛋白在新鮮胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá) 16例新鮮胃癌組織及其鄰近癌旁組織中Ezrin蛋白的表達(dá)程度不同，其中第13，15例患者的腫瘤組織及癌旁組織均未檢測(cè)出Ezrin蛋白的表達(dá)。Image J灰度分析軟件分析結(jié)果顯示（排除第13，15例），Ezrin蛋白表達(dá)相對(duì)強(qiáng)度在胃癌組織為（0.796 2±0.494 5），明顯高于其在鄰近癌旁組織中的表達(dá)（0.435 5±0.418 5），2組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.560，P＝0.023 7，圖2）。

圖1 Ezrin蛋白在癌旁組織、胃癌組織和轉(zhuǎn)移灶組織中的表達(dá)情況（ ×400）Fig 1 Representative Ezrin immunostaining in normal gastric tissues，primary gastric tumors and metastasis from the same patient（ ×400）

圖2 16例胃癌組織及其鄰近癌旁組織的Western－blot檢測(cè)結(jié)果Fig 2 The expression of Ezrin protein in fresh tissue samples obtained from 16patients

2.3 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

2.3.1 胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞MKN－45后，采用 Western－blot技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（E－SH1、E－SH2）和對(duì)照組（E－control）基因敲除效率。實(shí)驗(yàn)組Ezrin蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組（圖3）。采用MTT法測(cè)定胃癌細(xì)胞MKN－45生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞E－SH1和E－SH2的生長(zhǎng)減慢，生長(zhǎng)速率明顯受到抑制，與E－control組細(xì)胞間差別顯著（F＝4.787，P＝0.006），而E－SH1和E－SH2之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.956，圖4）。

圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因敲除效率比較Fig 3 Ezrin protein levels were decreased in target cells

2.3.2 胃癌細(xì)胞侵襲能力 采用Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定胃癌細(xì)胞MKN－45侵襲能力，結(jié)果顯示，與E－control相比，E－SH1和E－SH2細(xì)胞侵襲能力均明顯降低（P＜0.01）；經(jīng)過結(jié)晶紫染色，其24h穿過基質(zhì)膠并貼于聚碳酸脂膜底面的細(xì)胞數(shù)分別為E－SH1（65±3.1）個(gè)／HP，E－SH2（60±2.6）個(gè)／HP和E－control（126±6.0）個(gè)／HP（圖5，6）。相關(guān)（表1），而與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、Borrmann分型、組織學(xué)分型、腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM分期無顯著相關(guān)性。

圖4 Ezrin基因表達(dá)下調(diào)后對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig 4 The proliferation rates of the cell lineswere detected using a MTT assay

2.4 Ezrin蛋白表達(dá)與胃癌患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系

2.4.1 Ezrin蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系206例中，Ezrin蛋白高表達(dá)與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著

圖5 Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞侵襲能力（ ×400）Fig 5 Representative images of invasive cells on polycarbonate transwell membranes（ ×400）

表1 胃癌組織中Ezrin表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)間的關(guān)系Tab 1 The relationship between clinicopathological parameters and Ezrin expression in gastric cancer

圖6 Ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)后對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲力的影響Fig 6 The average number of invasive cells from three independent experiments are shown

2.4.2 影響患者生存的預(yù)后因素分析 預(yù)后因素分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白的表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)（表2）。全組患者術(shù)后5年生存率為46.1%；Ezrin蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)組的術(shù)后5年生存率明顯低于弱陽性表達(dá)組（37.8%vs55.8%，P＜0.05，圖7）。

圖7 Erzin蛋白表達(dá)水平與患者術(shù)后5年生存率之間的關(guān)系Fig 7 Impact of Ezrin on overall survival in gastric cancer

表2 影響胃癌患者生存期的單因素分析Tab 2 Univariate analysis by the Kaplan－Meier method of factors affecting overall survival

2.5 Ezrin蛋白對(duì)胃癌增殖侵襲機(jī)制

2.5.1 CD44v6在胃癌組織、癌旁組織中的表達(dá)CD44v6在胃癌組織中的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。正常癌旁組織中CD44v6呈低表達(dá)，而在胃癌組織中呈高表達(dá)（圖8）。

2.5.2 Ezrin蛋白與CD44v6在胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在胃癌組織中，Ezrin強(qiáng)陽性表達(dá)組CD44v6強(qiáng)陽性占68.5%，Ezrin弱陽性表達(dá)組CD44v6強(qiáng)陽性占42.1%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果表明，兩者表達(dá)呈顯著正相關(guān)（R＝0.265，P＜0.001）。

圖8 CD44v6蛋白在癌旁組織、胃癌組織中的表達(dá)情況Fig 8 Representative CD44v6immunostaining in normal gastric tissues and primary gastric tumors from the same patient

3 討 論

我國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)，全球每年42%的胃癌新發(fā)病例在中國(guó)[1－2]。近年來，胃癌的發(fā)生率及死亡率在大多數(shù)國(guó)家均有不同程度的降低[7－8]，但是與世界其他國(guó)家比較，我國(guó)胃癌死亡率仍高居首位[9]。因此，探討胃癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防措施仍是當(dāng)前科學(xué)研究的重要任務(wù)。

近年來，Ezrin蛋白與人類惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。Wennersten等的一項(xiàng)隊(duì)列研究首次報(bào)道了Ezrin在泌尿系上皮腫瘤中的表達(dá)，結(jié)果顯示Ezrin蛋白在復(fù)發(fā)腫瘤中的表達(dá)顯著低于原發(fā)腫瘤，而Ezrin在胞膜和胞質(zhì)的低表達(dá)與更差的腫瘤分期和分化程度密切相關(guān)[10]。然而，Jin等對(duì)150例非小細(xì)胞肺癌的研究表明，Ezrin蛋白高水平表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多、腫瘤分期更晚，并認(rèn)為Ezrin可能成為預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物[11]。Saito等的研究發(fā)現(xiàn)，Erzin蛋白在46.4%的舌鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，可能通過 E－cadherin／β－catenin復(fù)合體促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，有望成為舌鱗狀細(xì)胞癌的新治療靶點(diǎn)，是早期伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌的預(yù)后因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白在胃癌原發(fā)灶組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織（P＜0.05），在腹膜轉(zhuǎn)移灶組織中的強(qiáng)陽性表達(dá)率顯著高于原發(fā)灶癌組織（P＜0.05）。此外，蛋白印跡也證實(shí)，Ezrin蛋白在胃癌組織中的相對(duì)強(qiáng)度明顯高于其在癌旁組織中的表達(dá)（P＝0.023 7）。通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和測(cè)定細(xì)胞侵襲能力后發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白表達(dá)下調(diào)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速率明顯受到抑制且侵襲能力明顯降低（P＜0.001）。進(jìn)一步對(duì)Ezrin蛋白的表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)組中的N3期患者比例顯著增高（P＜0.001）。這些結(jié)果提示，Ezrin蛋白可能是與胃癌生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因，其在胃癌組織中的高表達(dá)可能促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Ezrin蛋白對(duì)腫瘤患者預(yù)后的影響也逐漸被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視。瑞典的新近研究表明，Ezrin蛋白在胞膜和胞質(zhì)的低表達(dá)與患者術(shù)后5年總體生存率密切相關(guān)，而胞膜低表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。Jin等對(duì)108例非小細(xì)胞肺癌的分析發(fā)現(xiàn)，Ezrin蛋白高表達(dá)是影響Ⅰ～Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌患者總體生存率的危險(xiǎn)因素（P＜0.05），但是對(duì)Ⅲ～Ⅳ期患者，Ezrin蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組的預(yù)后相當(dāng)（P＞0.05）[11]。本組研究的預(yù)后因素分析顯示，除腫瘤大小、Borrmann分型、組織學(xué)分型、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期外，Ezrin蛋白的表達(dá)水平也與患者預(yù)后密切相關(guān)；Kaplan－Meier生存曲線顯示，胃癌組織中Ezrin蛋白強(qiáng)陽性表達(dá)患者的術(shù)后5年生存率明顯低于弱陽性表達(dá)的患者。這表明隨著癌組織中Ezrin蛋白表達(dá)水平的降低，患者的5年生存率隨之提高。推測(cè)Ezrin基因及其蛋白有可能成為診斷治療胃癌患者的一個(gè)靶點(diǎn)。

關(guān)于Ezrin蛋白在胃癌中的作用機(jī)制，Wang等研究認(rèn)為，Ezrin蛋白在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于Ezrin蛋白在胃癌組織中表達(dá)的失衡是否涉及產(chǎn)物或通路間的相互作用及哪些產(chǎn)物或通路，遠(yuǎn)未被闡明[3]。CD44是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與Ezrin共表達(dá)的黏附分子，CD44v6作為CD44的主要變異體，其胞質(zhì)區(qū)能與Ezrin形成復(fù)合體，在很多高侵襲和轉(zhuǎn)移活性的腫瘤細(xì)胞中都存在過量表達(dá)[13－14]。Hefler 等 的 研 究 顯 示，Ezrin 可 以 與CD44v6結(jié)合后與細(xì)胞骨架連接，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，同時(shí)CD44v6表達(dá)上調(diào)，使功能性Ezrin表達(dá)增加，此時(shí)腫瘤增殖與侵襲能力也隨之增加[15]。本研究顯示，正常胃黏膜組織中CD44v6呈低表達(dá)，而在胃癌組織中呈高表達(dá)；而且，CD44v6在胃癌組織中表達(dá)與Ezrin蛋白呈顯著正相關(guān)，提示胃癌組織中Ezrin蛋白的高表達(dá)可能需要CD44v6的參與。筆者推測(cè)，Ezrin蛋白可能通過CD44v6影響胃癌增殖及侵襲。在下一階段的實(shí)驗(yàn)中，筆者將深入探討兩者的內(nèi)在聯(lián)系。

綜上所述，Ezrin蛋白在胃癌組織中較癌旁組織表達(dá)明顯上調(diào)，在腹膜轉(zhuǎn)移灶組織較原發(fā)胃癌組織表達(dá)亦明顯上調(diào)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的術(shù)后5年生存率顯著相關(guān)。Ezrin蛋白改變胃癌生物學(xué)行為的機(jī)制可能與CD44v6的參與關(guān)系密切，但是具體的信號(hào)通路仍需后續(xù)研究繼續(xù)探索。

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