陳　卓，劉國良，王　偉

(1.安徽理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 淮南　232001; 2.鹽城工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鹽城　224051)

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碳點(diǎn)的制備及其生物成像與生物檢測應(yīng)用

陳卓1,2，劉國良2，王偉1,2

(1.安徽理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 淮南232001; 2.鹽城工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鹽城224051)

摘要：碳點(diǎn)(CDs)作為一種新的含碳熒光納米粒子，由于其良好的生物相容性引起了廣泛的關(guān)注。碳點(diǎn)不僅被用于生物成像探針，還被用來作為生物傳感探針。目前，碳點(diǎn)的合成、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、熒光機(jī)理以及對生物相容性和生物應(yīng)用的評價(jià)等方面都有了很大的進(jìn)展。從碳點(diǎn)的合成方法、熒光性質(zhì)以及在生物成像和生物檢測應(yīng)用方面進(jìn)行了概述，重點(diǎn)闡述了碳點(diǎn)用于熒光比率傳感的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，并對碳點(diǎn)研究的發(fā)展方向和應(yīng)用前景進(jìn)行了評述與展望。

關(guān)鍵詞：碳點(diǎn)；熒光探針；生物成像；生物檢測；傳感；綜述

在生命科學(xué)體系中，許多基本生命活動過程的研究依賴于對生物分子間以及生物分子與一些離子或小分子相互作用做出快速、靈敏、可靠和可重復(fù)的檢測[1]。如今社會，隨著人們對健康以及疾病診斷和治療的關(guān)注度逐漸增加，對這些物質(zhì)檢測的關(guān)注也隨之增加。但是生命體系的多樣性和復(fù)雜性，使得對這些物質(zhì)的檢測也面臨著挑戰(zhàn)。熒光檢測法由于靈敏度高、選擇性好、操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)成為對這些物質(zhì)進(jìn)行檢測的重要手段之一。此外，熒光領(lǐng)域有多樣的熒光發(fā)色團(tuán)可供選擇，如熒光納米粒子，包括量子點(diǎn)(QDs)、金屬團(tuán)簇、染料修飾的納米粒子和稀土材料粒子，這些熒光發(fā)色團(tuán)受到相關(guān)領(lǐng)域特別是生物領(lǐng)域的日益關(guān)切而快速發(fā)展。在過去的10年，對這些熒光物質(zhì)的研究和開發(fā)重點(diǎn)主要集中在生物檢測和生物成像方面[2-3]，尤其含Cd的量子點(diǎn)(如CdSe，CdTe等)已經(jīng)被證明在電磁波譜的可見范圍內(nèi)具有極高的量子產(chǎn)率和尺寸可調(diào)發(fā)射的性能[4-5]。不過，可惜的是，QDs合成一般都需要重金屬(例如鎘、鉛等)，這些重金屬會對環(huán)境有潛在危害，并且它們的持久毒性限制了在生物體內(nèi)的應(yīng)用。出于這些考慮，研究者轉(zhuǎn)向?qū)ふ倚再|(zhì)溫和的量子點(diǎn)以代替QDs，從而對環(huán)保、低毒的熒光納米粒子的研究產(chǎn)生了很大的興趣。

碳納米材料(如碳納米管、富勒烯、石墨烯等)由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)成為目前研究的熱點(diǎn)。碳點(diǎn)作為碳納米材料的一種，是最有希望替代QDs的納米材料[6]。 碳點(diǎn)的尺寸一般小于10 nm，具有尺寸和激發(fā)波長可調(diào)的熒光性質(zhì)。碳點(diǎn)不僅具有良好的熒光性和耐光漂白性，還具有很好的水溶性、低細(xì)胞毒性以及良好的生物相容性。碳點(diǎn)的這些特性使其逐步取代傳統(tǒng)重金屬量子點(diǎn)在生物領(lǐng)域如細(xì)胞標(biāo)記、生物成像與檢測、藥物釋放等方面的應(yīng)用[7-10]。

1碳點(diǎn)的制備

到目前為止，碳點(diǎn)的合成可分為：自上而下和自下而上兩種路線。自上而下合成路線主要是通過激光消融、電化學(xué)氧化大塊石墨烯碎片初始物的方法制備碳點(diǎn)；自下而上合成路線主要是通過冷凝和碳化前驅(qū)體來制備碳點(diǎn)，其方法主要有熱解法、微波輔助法和水熱法3種。

1.1　自上而下合成碳點(diǎn)

1.1.1激光消融法

Sun等[11]發(fā)明了激光消融法并成功運(yùn)用此法將碳靶材等合成制得碳點(diǎn)，方法如下：首先將石墨粉和粘土混合物通過烘烤、成型、退火三步熱處理制得碳靶材，然后采用 Q 開關(guān) Nd:YAG (1 064 nm，10 Hz)激光器消融，得到不同尺寸的碳納米顆粒初產(chǎn)物，再將初產(chǎn)物置于2.6 mol/L的硝酸中回流 12 h，得到無熒光性的納米碳顆粒，最后將其表面進(jìn)行簡單的有機(jī)物鈍化就使其從無熒光性的納米碳顆粒變成熒光性納米碳點(diǎn)。Hu等[12]通過對石墨或炭黑均勻分散的有機(jī)溶劑溶液進(jìn)行激光消融也制得了碳點(diǎn)，方法是：用波長為1.064 mm，功率密度為60×106 W cm2的Nd:YAG激光器對上述溶液激光輻射2 h，得到粒子分散液，通過離心除去大顆粒的黑色碳不溶物，取上清液即可得到均勻分散的熒光納米碳點(diǎn)。為了加快碳顆粒的運(yùn)動，整個(gè)過程需要在超聲作用下進(jìn)行。研究表明，雖然用不同的初始物(碳或石墨)和表面鈍化有機(jī)溶劑(PEG200N、水合肼、二乙醇胺)都可以方便有效地合成碳點(diǎn)，但是，表面鈍化劑的不同會改變碳點(diǎn)的量子產(chǎn)率。用水合肼表面鈍化的碳點(diǎn)熒光量子產(chǎn)率為 3.7%，而用二乙醇胺鈍化的碳點(diǎn)可達(dá)7.8 %，因而可通過改變表面鈍化有機(jī)試劑來調(diào)控碳點(diǎn)的不同熒光性能。

1.1.2電化學(xué)氧化法

電化學(xué)氧化法制備碳點(diǎn)簡單、溫和而又方便，用一個(gè)普通的電化學(xué)電池就可以制備。電化學(xué)電池由一個(gè)工作電極(WE)、一個(gè)參比電極(RE)、一個(gè)對電極(CE)和電解質(zhì)組成，工作電極是碳材料，也可以是多壁碳納米管、石墨棒、碳糊電極碳纖維[13-16]等。電化學(xué)法制備碳點(diǎn)的原理是：應(yīng)用循環(huán)伏安法將工作電極在電解質(zhì)中進(jìn)行連續(xù)電壓掃描，通過調(diào)節(jié)電壓和電流密度精確地控制碳點(diǎn)合成。Bao等[17]用電化學(xué)氧化法成功合成了碳點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)是以碳纖維作為工作電極，鉑片和銀線分別作為對電極和參比電極，0.1 mol/L的四丁基高氯酸銨(TBAP)乙腈溶液作為電解質(zhì)，通過電壓調(diào)節(jié)來控制碳點(diǎn)尺寸的大小。電壓越大得到的碳點(diǎn)尺寸越小，對于粒徑分布窄的碳點(diǎn)可以通過此方法直接獲得而不需要進(jìn)一步地分離或者表面鈍化。顯然，電化學(xué)方法具有易操作、低成本和高產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)。

1.1.3炭灰剝落法

蠟燭、煤油燈和植物等不完全燃燒時(shí)會產(chǎn)生碳納米顆粒，它們之間因緊密連接而聚集。高溫時(shí)，聚集的碳顆粒經(jīng)過長時(shí)間強(qiáng)酸的作用而分解，形成碳點(diǎn)[18]。碳點(diǎn)在普通環(huán)境下放置幾個(gè)月依然性能穩(wěn)定，碳點(diǎn)還可以被單束波長的光激發(fā)，發(fā)射出很多顏色的光。Liu等[19]通過蠟燭灰制備并提純了碳點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)證明該碳點(diǎn)表面富含羧基基團(tuán)，可使其通過與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)多肽縮合劑作用而進(jìn)行生物大分子功能化。與這些炭灰相似的燒烤炭灰也可以用來合成明亮的熒光碳點(diǎn)，如烤牛肉的炭灰樣品用丙酮洗滌，經(jīng)過蒸發(fā)和熱處理后，再在2.5 mol/L的硝酸溶液里回流，經(jīng)離心去除上層懸浮物后再透析，便得到不同量子產(chǎn)率混和的具有穩(wěn)定水溶性的碳點(diǎn)溶液。不同量子產(chǎn)率的碳點(diǎn)是由碳點(diǎn)表面鈍化反應(yīng)的不同進(jìn)程造成的。將混合納米材料的溶液在G-100凝膠柱里分餾，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)納米材料的熒光產(chǎn)率接近40%[20]，表明高性能的碳點(diǎn)可以通過一系列豐富的可再生材料制備得到。

1.2　自下而上合成碳點(diǎn)

雖然自上而下的合成方法是非常有效的制備理想碳點(diǎn)的常用方法，但是自下而上的方法因其具有低成本和綠色合成等優(yōu)點(diǎn)[21]，而使其能夠避免昂貴的碳源材料和繁多的實(shí)驗(yàn)步驟因此被廣泛采用。

圖1　碳點(diǎn)由蛋白質(zhì)和碳水化合物制得的可能機(jī)理示意圖[30]Fig.1　Schematic illustration of the possible mechanism of CDs formation from proteins and carbohydrates

目前，自下而上的碳點(diǎn)合成研究主要集中在綠色碳源上，例如，牛奶、橙汁、香蕉汁、柳樹皮、雞蛋、辣椒和樹葉[22-29]等，這些碳源物質(zhì)有的包含蛋白質(zhì)，如膠原蛋白、大豆蛋白等，有的包含糖類，如淀粉、葡萄糖和果糖等，它們均已成功地合成了碳點(diǎn)。圖1為從兩種前驅(qū)體(蛋白質(zhì)和碳水化合物)制備碳點(diǎn)的機(jī)理推測示意圖[30]。

自下而上合成碳點(diǎn)的方法包括四個(gè)過程。用碳水化合物作碳源時(shí)，碳水化合物經(jīng)過水解、脫水和分解反應(yīng)得到單糖類物質(zhì)(可溶性化合物糠醛和酮類)；用蛋白質(zhì)為碳源時(shí)，蛋白質(zhì)完全水解得到氨基酸混合物。聚合和冷凝上述物質(zhì)成為可溶性的聚合物，這些聚集體在過度飽和而超過臨界濃度的時(shí)候會核破裂形成碳點(diǎn)。如果需要提高碳點(diǎn)的熒光性質(zhì)可以對其進(jìn)行碳化。

目前，自下而上合成碳點(diǎn)的方法主要有熱解法、微波輔助法和水熱法。

1.2.1熱解法

熱解是一種簡單且大規(guī)模制備碳點(diǎn)的方法[31-32]，該方法制得的熒光碳點(diǎn)具有激發(fā)波長可調(diào)、pH可調(diào)和上轉(zhuǎn)換熒光性能等優(yōu)點(diǎn)。此外，碳點(diǎn)表面存在的羥基和羧基基團(tuán)，使其具有較好的水溶性。Jia等[33]直接對抗壞血酸的水溶液加熱到90 ℃，合成了重量超過6.0 g的碳點(diǎn)，其形狀為粒徑達(dá)(3.20±0.72) nm的球形，晶格間距為0.208 nm，具有很好的分散性。Wang等[34]以十八烯為溶劑，十六胺為鈍化試劑，通過熱解檸檬酸得到油溶性碳點(diǎn)；再改變反應(yīng)溶劑和包覆試劑，又可制得水溶性碳點(diǎn)。

圖2a為合成的油溶性碳點(diǎn)的熒光發(fā)射圖，圖2b和圖2c分別是反應(yīng)5 min和180 min后碳點(diǎn)的紫外與熒光發(fā)射譜。由圖2a可以看出，在不同的激發(fā)波長下，碳點(diǎn)發(fā)出不同顏色的熒光。由圖2b可以看出，隨著激發(fā)波長的增大，熒光發(fā)射圖的波峰發(fā)生紅移，半峰寬(FWHM)為100 nm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它半導(dǎo)體的量子點(diǎn)；此外，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，油溶性碳點(diǎn)的激發(fā)波長也變大。反應(yīng)為5 min時(shí)，油溶性碳點(diǎn)只能在很窄的波長范圍(340~480 nm) 內(nèi)激發(fā)；反應(yīng)為3 h時(shí)，激發(fā)波長范圍變大并且顯著地向長波長轉(zhuǎn)變(340~560 nm)。同時(shí)，發(fā)射譜的強(qiáng)度也隨之增大(圖2c)。當(dāng)激發(fā)波長為360 nm時(shí)，油溶性碳點(diǎn)的最高熒光產(chǎn)率達(dá)到53%，并且在兩個(gè)月后也幾乎不變。

圖2　(a)在激發(fā)180 min之后的油溶性碳點(diǎn)的圖片[34];在反應(yīng)5 min(b) 和180 min;(c)后的紫外和熒光發(fā)射譜Fig.2　(a)Photograph of the toluene solution of oil soluble CDs after a 180 min reaction excited by a fluorescent, and the absorption and photoluminescence emission spectra of the oil-soluble CDs reacted for (b) 5 min (c) 180 min.

1.2.2微波輔助法

微波因能集中高效的能量并節(jié)約反應(yīng)時(shí)間，而吸引了研究者對微波輔助法合成碳點(diǎn)的廣泛興趣。Chowdhury等[35]用微波輔助法以殼聚糖凝膠為碳源合成了碳點(diǎn)，通過動態(tài)光散射(DLS)法測得其粒徑為0.6~8.7 nm。該碳點(diǎn)熒光性能表現(xiàn)為：當(dāng)激發(fā)波長從300 nm逐漸增加到400 nm時(shí)，碳點(diǎn)的發(fā)射波長逐漸紅移，相應(yīng)的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。Safavi等[36]以離子液體OPPF6作為前體，用微波方法合成了碳點(diǎn)。在合成過程中，將與水不混溶的OPPF6離子液體置于試管內(nèi)，放在微波爐里于450 W下加熱2 min左右，離子液體逐漸由無色變?yōu)辄S色，最后變?yōu)樯钭厣奶键c(diǎn)。該碳點(diǎn)的FWHM值為17 nm，比之前報(bào)道的大多數(shù)碳點(diǎn)的FWHM值要小，表明合成的碳點(diǎn)高度分散。通過高分辨率的透射電鏡(HRTEM)觀察，該碳點(diǎn)的平均大小為6 nm，晶格間距為3.22 ?，與石墨的002面相符。該碳點(diǎn)在pH值為4~9的溶液中，熒光強(qiáng)度比較穩(wěn)定；以硫酸奎寧為參比，熒光量子產(chǎn)率為27%。

1.2.3水熱法

水熱法合成碳點(diǎn)的典型路線是把碳源混合液放進(jìn)聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在180~240 ℃的溫度下放置數(shù)小時(shí)即可完成。在此合成過程不需要多步鈍化與昂貴的試劑以及精密儀器[37-39]。Zhang等[40]以牛血清蛋白(BSA)為碳源，以4,7,10-三氧-1和13-十三烷二胺(TTDDA)為表面鈍化劑和穩(wěn)定劑，通過水熱法合成了熒光量子產(chǎn)率為11%的碳點(diǎn)。該碳點(diǎn)量子產(chǎn)率是以硫酸奎寧為參比液計(jì)算得到的，其量子產(chǎn)率較高的原因是因?yàn)門TDDA的作用。TTDDA作為表面鈍化劑不僅可以增強(qiáng)碳點(diǎn)的熒光性，還可以避免碳點(diǎn)在水熱過程中聚集，形成較大的碳點(diǎn)顆粒。該碳點(diǎn)在360 nm激發(fā)時(shí)，在448 nm處有很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰。Sahu等[23]以橘子汁為碳源，在較低的溫度(120 ℃)下反應(yīng)不到150 min，就得到高產(chǎn)量的綠色碳點(diǎn)，其熒光量子產(chǎn)率為26%。從碳點(diǎn)的HRTEM圖像可以清晰地看出，該碳點(diǎn)是球形的且分散性很好；尺寸分布很窄(1.5~4.5 nm)，以2.5 nm尺寸的碳點(diǎn)為最多；晶格間距0.18 nm，歸因于石墨碳晶面。這種部分晶體結(jié)構(gòu)的碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度既強(qiáng)又穩(wěn)定，并且隨著激發(fā)波長和溶液pH值的改變而改變。高熒光性能的碳點(diǎn)可以通過對檸檬酸和乙二胺水處理得到，此方法制備出的碳點(diǎn)熒光產(chǎn)率高達(dá)80%[41]。

2影響碳點(diǎn)熒光性質(zhì)的因素

碳點(diǎn)最顯著的特點(diǎn)是它的熒光性能，碳點(diǎn)的熒光性能使其在生物成像和生物檢測等方面應(yīng)用廣泛。目前，雖然碳點(diǎn)的熒光機(jī)理仍未研究透徹，但已有的研究表明：量子限域效應(yīng)、原子結(jié)構(gòu)/含氧基團(tuán)、自由的彎折位置和/或邊緣缺陷等與碳點(diǎn)的熒光性能有關(guān)，該方面的理論已被大多數(shù)研究者認(rèn)同。

2.1　碳點(diǎn)尺寸對其熒光性能的影響

較大的碳粒子(例如平均粒徑為30~50 nm)比較小的碳粒子熒光性能差，但其熒光量子產(chǎn)率卻比較小的粒子高。所以，在碳點(diǎn)表面必然有一個(gè)能量量子限域，也就是說，碳點(diǎn)粒子要有足夠大的表面體積比才能使粒子表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光性能。用目前方法合成的碳點(diǎn)都是由不同尺寸粒子組成的混合物，其熒光譜圖大多數(shù)是很寬的，發(fā)射譜覆蓋了可見波長區(qū)域，甚至可以延伸到近紅外區(qū)域[42]。因此，目前制備的碳點(diǎn)需要通過離心過濾設(shè)備進(jìn)行超濾分離。Li等[43]通過柱層析法分離提純了合成好的碳點(diǎn)，得到了尺寸分布窄的不同尺寸的碳點(diǎn)。圖3a為其中4種尺寸類型的碳點(diǎn)在日光和紫外光照射下的光譜圖。從圖3a可以看出，碳點(diǎn)具有很強(qiáng)的熒光性；不同尺寸的碳點(diǎn)發(fā)射出不同顏色的光，在紫外光下分別呈現(xiàn)湖藍(lán)色、綠色、黃色和紅色；當(dāng)分子量增加時(shí)，碳點(diǎn)的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜都發(fā)生紅移，表明熒光性質(zhì)與碳點(diǎn)的量子尺寸有關(guān)。圖3b為4種碳點(diǎn)在紫外光下的熒光曲線圖，圖中紅色、黑色、綠色和藍(lán)色熒光曲線分別對應(yīng)于圖3a中紫外燈輻射下湖藍(lán)色、綠色、黃色和紅色碳點(diǎn)的熒光譜。圖3c為碳點(diǎn)尺寸與熒光性質(zhì)的關(guān)系圖。從圖3c可以看出，1.2 nm的小尺寸碳點(diǎn)發(fā)射紫外光(350 nm左右)；1.5~ 3.0 nm的中等尺寸的碳點(diǎn)發(fā)射可見光(400~700 nm)；3.8 nm的大尺寸碳點(diǎn)發(fā)射紫外光(800 nm左右)。圖3d為最高已占軌道(HOMO)與最低未占軌道(LUMO)間的帶隙與石墨烯碎片尺寸的關(guān)系。從圖3d可以看出，當(dāng)碎片尺寸變大時(shí)，帶隙逐漸減少。從直徑為14~22?石墨烯碎片可以得到可見光范圍內(nèi)的隙能，這與粒徑低于3 nm的碳點(diǎn)可見光發(fā)射一致。因此，我們可以得出結(jié)論，碳點(diǎn)的強(qiáng)熒光發(fā)射來源于其自身量子尺寸的石墨烯結(jié)構(gòu)。

圖3　(a)4種類型尺寸的碳點(diǎn)在日光(左邊)和紫外光(右邊：365 nm)下的光譜圖[44]；(b)4種類型尺寸的碳點(diǎn)在紫外光下的熒光曲線圖[44]；(c)碳點(diǎn)尺寸與熒光性質(zhì)的關(guān)系圖；(d)HOMO-LUMO隙能與石墨烯碎片大小的關(guān)系。Fig.3　(a)Typical sized CDs optical images illuminated under white (left; daylight lamp) and UV light (right; 365 nm). (b) PL spectra of typical sized CDs: the red, black, green, and blue lines are the PL spectra for blue-, green-, yellow-, and red-emission CDs, respectively. (c) Relationship between the CDs size and the PL properties. (d) HOMO-LUMO gap dependence on the size of the graphene fragments.

2.2　碳點(diǎn)表面結(jié)構(gòu)對其熒光性質(zhì)的影響

不僅碳點(diǎn)的尺寸會影響其熒光性質(zhì)，碳點(diǎn)表面結(jié)構(gòu)對其熒光性質(zhì)也有很大影響。表面結(jié)構(gòu)主要來自其表面氧化，表面氧化使碳點(diǎn)表面存在缺陷。不同的表面缺陷會有不同的發(fā)射峰位置，從而導(dǎo)致發(fā)射光譜強(qiáng)度發(fā)生變化。值得注意的是，碳點(diǎn)表面氧化程度越高，其表面缺陷越嚴(yán)重，從而捕捉到更多的激子，捕捉到的更多激子在其整個(gè)輻射過程即熒光發(fā)射過程會引起紅移[44]。碳點(diǎn)表面沒有帶隙吸收，表面缺陷結(jié)構(gòu)必須直接從基態(tài)獲得。因此，激發(fā)態(tài)能量最有可能在缺陷(吸收和發(fā)射)間獲得[45]。

3碳點(diǎn)的應(yīng)用

3.1　細(xì)胞成像

Ray等[46]以硝酸氧化煙灰的方法制得碳點(diǎn)，并將其用于細(xì)胞成像。實(shí)驗(yàn)選取Ehrlich腹水癌細(xì)胞(EAC)作為研究對象。在接種癌細(xì)胞7 d后從成年雌性小鼠的腹腔內(nèi)提取EAC，濃度大約為107個(gè)/mL。取1 mL上層懸浮液與0.01~0.1 mL的碳點(diǎn)溶液混合并培育30 min，置于轉(zhuǎn)速為2 000 rpm/min的離心機(jī)中離心3 min，將得到的細(xì)胞溶于PBS。重復(fù)此操作2次，最終得到PBS細(xì)胞溶液。在載玻片上滴1滴此細(xì)胞溶液做成像實(shí)驗(yàn)，用Olympus IX71熒光顯微鏡觀察并用DP70數(shù)碼相機(jī)拍攝圖片，如圖4所示。從圖4可以看出，細(xì)胞溶液在紫外激發(fā)下變?yōu)楣饬恋乃{(lán)綠色，在藍(lán)光激發(fā)下變?yōu)辄S色，而在未加入碳點(diǎn)溶液的對比實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞是無色的。由此說明，細(xì)胞在紫外與藍(lán)光激發(fā)下的顏色變化是由于其在碳點(diǎn)作用下自動發(fā)出熒光的結(jié)果。因此，利用納米粒子的熒光性質(zhì)可以通過普通的熒光顯微鏡在細(xì)胞內(nèi)示蹤碳點(diǎn)的位置。

3.2　生物檢測

碳點(diǎn)已被廣泛用于生物傳感器檢測DNA、維生素、碳水化合物和蛋白質(zhì)，然而，作為熒光探針在生物分析檢測中的應(yīng)用卻仍處于初期階段。碳點(diǎn)由于其有機(jī)表面的可調(diào)諧功能，以及很好的熒光性和高穩(wěn)定性，可以在生物傳感器中作為熒光信號。下面主要從熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)比率熒光傳感器、電子轉(zhuǎn)移比率熒光傳感器以及其它新型的碳點(diǎn)靈敏生物傳感器進(jìn)行概述。

3.2.1FRET比率熒光傳感器

FRET是供體分子被激發(fā)后將能量轉(zhuǎn)移給受

圖4　加入碳點(diǎn)(上排)與未加入碳點(diǎn)(下排)的 EAC細(xì)胞熒光對比圖[46]Fig.4　Fluorescent CD-based labeling(up) and non-labeling(down) of EAC cells

體的非輻射過程。FRET因其作為傳感的方便性以及業(yè)已形成的理論基礎(chǔ)，被廣泛應(yīng)用于比率檢測。在一個(gè)FRET過程中，以兩個(gè)相互連接的熒光信號作為探針可以有效避免背景干擾和環(huán)境干擾。在以碳點(diǎn)為模板制備的FRET比率熒光傳感器中，碳點(diǎn)不僅可以作為供體還可以作為受體[47]。圖5為FRET比率熒光傳感器示意圖。Yu等[48]證明了碳點(diǎn)可以與有機(jī)染料構(gòu)建FRET模式，并在水溶液、生物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)檢測H2S。該模式中碳點(diǎn)為供體，其檢測H2S的機(jī)理是：制備傳感器時(shí)，將萘二甲酸亞胺(用作H2S探針)共價(jià)耦合到碳點(diǎn)表面，當(dāng)其與H2S特異性反應(yīng)時(shí)，萘酰亞胺成為能量受體，并在425 nm附近有吸收峰，在526 nm附近有發(fā)射峰。該生物傳感器具有很好的選擇性和靈敏性，檢出限可低至 10 nm。如果將上面?zhèn)鞲衅鞯哪芰渴荏w換為NO，就可以制得檢測NO的比率熒光傳感器[49]，該傳感器可以在細(xì)胞內(nèi)示蹤NO，如HeLa細(xì)胞和L929 細(xì)胞。

圖5　FRET比率熒光傳感器示意圖Fig.5　Schematic illustration of the FRET ratiometric fluorescent biosensor

3.2.2電子轉(zhuǎn)移比率熒光傳感器

碳點(diǎn)之所以有超高的熒光性能是因?yàn)榧ぷ拥妮椛渥饔?，然而，碳點(diǎn)的熒光可以被電子受體或者電子供體有效地猝滅，也就是說電子受體或者電子供體影響著激子的輻射。在電子轉(zhuǎn)移(ET)過程中會有非輻射的電子-空穴對產(chǎn)生，如果碳點(diǎn)表面的電子轉(zhuǎn)移過程被中斷，碳點(diǎn)的熒光就會恢復(fù)。人們利用這種“off-on”的過程，成功地設(shè)計(jì)了基于碳點(diǎn)的生物分子傳感器。Wang等[50]發(fā)現(xiàn)在大量銅離子存在的碳點(diǎn)溶液，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度被猝滅；加入谷胱甘肽后，碳點(diǎn)的熒光又被部分地恢復(fù)；當(dāng)加入谷胱甘肽的濃度從0.01~200 mmol/L逐漸增加時(shí)，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并在100 mmol/L時(shí)趨于穩(wěn)定。因此，通過熒光碳點(diǎn)的“off-on”效應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)對谷胱甘肽的檢測。該傳感器檢測的線性范圍是0.5~80 mmol/L，檢出限是0.48 nm。Zong等[51]發(fā)現(xiàn)被銅離子猝滅的碳點(diǎn)熒光可以被L-半胱氨酸恢復(fù)，原因是L-半胱氨酸不僅能夠阻隔碳點(diǎn)的熒光被銅離子猝滅，還能與銅離子結(jié)合，使其離開碳點(diǎn)表面從而恢復(fù)碳點(diǎn)熒光。由此，人們設(shè)計(jì)了檢測L-半胱氨酸的傳感器，該傳感器檢出限可低至0.34 nm。Du等[52]報(bào)導(dǎo)了檢測碘的傳感器，其原理是被汞離子猝滅的碳點(diǎn)熒光可以被碘化物恢復(fù)，因而可以據(jù)此檢測碘化物。此生物傳感器可應(yīng)用于水溶液和尿液中檢測碘。

3.2.3芬頓反應(yīng)熒光傳感器

生物檢測是碳點(diǎn)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一。雖然已有許多基于FRET或ET過程的檢測乙酰膽堿、葡萄糖的傳感器，以及檢測多巴胺和金屬離子的生物傳感報(bào)道，但這些研究幾乎未被實(shí)際應(yīng)用于生物檢測中。這主要是因?yàn)樵谏锎呋^程中包含對熒光特性的化學(xué)控制，以及碳點(diǎn)在常見的氧化還原介質(zhì)如雙氧水溶液中展現(xiàn)出較強(qiáng)的耐光性[53]，限制了碳點(diǎn)的實(shí)際應(yīng)用。Wei等[54]首次報(bào)導(dǎo)了以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)合成了熒光性能好的水溶性碳點(diǎn)對羥基自由基的反應(yīng)，打開了碳點(diǎn)在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。圖6A為該碳點(diǎn)在H2O2(0.5

mmol/L)或 Fe2+(0.5 mmol/L)溶液中的熒光穩(wěn)定性。從圖6A可以看出，含0.5 mmol/L H2O2的碳點(diǎn)溶液在410 nm處的熒光強(qiáng)度幾乎保持不變，含0.5 mmol/L Fe2+的碳點(diǎn)溶液也基本如此，表明碳點(diǎn)對H2O2和Fe2+是惰性的。圖6B為碳點(diǎn)在加入0.338 mmol/L Fe2+和25 μmol/L H2O2后隨時(shí)間變化的熒光猝滅圖。由圖6B可以看出，在H2O2和Fe2+同時(shí)存在的情況下，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度降低。由此可以猜想，碳點(diǎn)必須在H2O2和Fe2+同時(shí)存在的情況，其熒光才猝滅。在酸性條件下，H2O2與Fe2+反應(yīng)生成羥基自由基(·OH)，即芬頓反應(yīng)，因此，很有可能是芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的·OH使得碳點(diǎn)熒光猝滅?；诖?，人們成功地設(shè)計(jì)了檢測H2O2的碳點(diǎn)生物傳感器。該傳感器在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對H2O2的最低檢出限是0.1 μmol/L。另外，人們還設(shè)計(jì)了以碳點(diǎn)為熒光探針輕松檢測乙酰膽堿(Ach)和膽堿的環(huán)境友好且靈敏的生物傳感器。圖6C為該傳感器對乙酰膽堿(Ach)和膽堿的檢測圖。由圖6C可知，該傳感器對膽堿的檢測線性范圍為0.1~40 μmol/L，檢出限為0.1 μmol/L；對乙酰膽堿的檢測線性范圍是0.5~60 μmol/L，檢出限為0.5 μmol/L。

圖6　(A)碳點(diǎn)在H2O2(0.5 mmol/L)或Fe2+(0.5 mmol/L)的熒光穩(wěn)定性[55]。(B) 含H2O2(25 μmol/L)和Fe2+(0.338 mmol/L)的碳點(diǎn)溶液隨反應(yīng)時(shí)間的熒光變化圖。(C)膽堿和Ach的檢測;(a)以碳點(diǎn)為探針基于H2O2的檢測機(jī)理圖。(b)檢測膽堿的線性圖。(c)檢測乙酰膽堿線的線性圖。Fig.6　(A)Stability of CDs in the presence of H2O2 (0.5 mmol/L) or Fe2+ (0.5 mmol/L). (B)Time-dependent fluorescence changes of CDs in the presence of H2O2 (25 μmol/L) and Fe2+ (0.338 mmol/L). (C)Detection of choline and Ach; (a)the detection mechanism based on the detection of H2O2 using CDs as probes, (b)the detection curve of choline, and (c) the detection curve of Ach.

4結(jié)論與展望

碳點(diǎn)由于其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、低的細(xì)胞毒性以及良好的生物相容性成為生物領(lǐng)域不可或缺的新型納米材料。目前，碳點(diǎn)的制備以及表面修飾技術(shù)已經(jīng)達(dá)到成熟階段，而碳點(diǎn)的生物應(yīng)用卻處于初級階段，其應(yīng)用主要集中于生物成像和生物檢測領(lǐng)域。最新的研究報(bào)導(dǎo)將碳點(diǎn)用作生物熒光納米載體，給碳點(diǎn)在生物領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了新的希望。此外，隨著碳點(diǎn)磁性響應(yīng)性質(zhì)的新發(fā)現(xiàn)，相信其在生物領(lǐng)域會有更多元的應(yīng)用。

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Carbon Dots for Bioimaging and Biosensing Application

CHEN Zhuo1,2,LIU Guoliang2,WANG Wei1,2

(責(zé)任編輯：孫新華)

Abstract：Because of the outstanding biocompatibility, carbon dots (CDs), which are attracting extensive attention as new nanosized carbon-containing fluorescent nanoparticles, have been used as probes for bioimaging and biosensing. Major advances have been made in the synthesis, structure, properties, mechanism of fluorescence, and evaluation of biocompatibility and bio-applications. Investigations of preparation methods, fluorescent properties and applications as biosensors and in bioimaging for carbon dots are stated. This review highlights on the design and construct of a carbon dot based fluorescent ratiometric biosensing system. Meanwhile, this review provides perspectives on future opportunities and application.

Keywords：carbon dots; fluorescent probe; bioimaging; biosensing; sensors；review

作者簡介：陳卓(1991-)，女，江蘇宿遷人，碩士生，主要研究方向?yàn)楣饣瘜W(xué)傳感。

收稿日期：2015-03-15

中圖分類號：O657.34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-5322(2015)02-0049-10

doi:10.16018/j.cnki.cn32-1650/n.201502010