田　迎，盧光明，鄭　玲

近紅外熒光染料用于腫瘤檢測(cè)的初步研究

田迎，盧光明，鄭玲

目的：體內(nèi)外研究新型近紅外熒光染料IR-808對(duì)腫瘤的檢測(cè)作用，并初步探索其潛在的臨床應(yīng)用。方法：體外培養(yǎng)3種人腫瘤細(xì)胞（結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7），與濃度為20 μmol/L的IR-808共孵育20 min，以正常人胚腎細(xì)胞系293T作為對(duì)照；建立乳腺癌皮下瘤動(dòng)物模型，靜脈注射劑量為1 mg/kg的IR-808，24 h后觀察體內(nèi)成像效果；收集1例惡性胸水標(biāo)本，分別與同等濃度的染料孵育24和48 h，觀察其熒光信號(hào)的穩(wěn)定性，并與臨床病理結(jié)果比較，判斷其檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的效果。結(jié)果：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明近紅外熒光染料IR-808只靶向腫瘤成像；與胸水共孵育后，IR-808信號(hào)穩(wěn)定，初步證實(shí)其能檢測(cè)到標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞。結(jié)論：IR-808具有良好的靶向腫瘤成像的性能，利用此性質(zhì)可以用來(lái)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞，具有重要的應(yīng)用前景。

近紅外熒光染料IR-808；腫瘤；靶向成像

0　引言

惡性腫瘤一直是威脅人類健康和生命的重大疾病。目前，設(shè)計(jì)并制備無(wú)毒、靶向性能好且性能穩(wěn)定的分子探針一直是研究的熱點(diǎn)，對(duì)于臨床上診斷腫瘤細(xì)胞，尤其是惡性積液腫瘤細(xì)胞尤為迫切[1-2]。臨床上常規(guī)方法主要是細(xì)胞病理診斷和臨床生化檢查。細(xì)胞病理診斷一直被認(rèn)為是檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)，但是在某些形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞類型，例如腫瘤細(xì)胞和間皮細(xì)胞，其檢查存在誤差性[3]。

最近，近紅外（near-infrared，NIR）吲哚花菁染料以其特殊的靶向腫瘤近紅外成像且熒光信號(hào)穩(wěn)定、無(wú)需借助化學(xué)作用等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[4-6]。因此，本文選取新型近紅外熒光染料IR-808，初步驗(yàn)證其特殊性能，首次嘗試檢測(cè)臨床胸水中腫瘤細(xì)胞，開(kāi)發(fā)其潛在的臨床價(jià)值。

1　主要材料與方法

1.1主要材料與設(shè)備

近紅外花菁染料IR-808由第三軍醫(yī)大學(xué)史春夢(mèng)教授饋贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，Xenogen IVIS小動(dòng)物活體可見(jiàn)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Caliper公司，近紅外熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人胚腎細(xì)胞系293 T、腫瘤細(xì)胞系結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549以及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7均購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)條件參考ATCC要求，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每48 h傳代1次。細(xì)胞制成細(xì)胞爬片后分別與20 μmol/L IR-808及4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），DAPI孵育20 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，用近紅外熒光顯微鏡觀察（激發(fā)光：684～719 μm；發(fā)射光：740～950 μm）。

1.3動(dòng)物模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BAIB/c—nu/nu雌性裸鼠10只購(gòu)自南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，鼠齡6周，體質(zhì)量18 g。動(dòng)物隨機(jī)分成2組，正常對(duì)照組（n=5）和皮下移植瘤組（n=5）。皮下瘤動(dòng)物模型為乳腺癌動(dòng)物模型，待乳腺癌細(xì)胞系MCF-7匯合度達(dá)到80%后，收集細(xì)胞，5×106個(gè)/只接種于裸鼠后背部皮下。2組動(dòng)物分別尾靜脈注射0.2 ml生理鹽水和0.2 ml染料IR-808（生理鹽水稀釋，劑量為1 mg/kg）。24 h后用小動(dòng)物活體可見(jiàn)光成像系統(tǒng)對(duì)模型小鼠進(jìn)行X線掃描和近紅外熒光成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后解剖取組織再次進(jìn)行近紅外熒光成像。

1.4胸水檢測(cè)

收集1例臨床惡性腫瘤患者胸水標(biāo)本，孵育IR-808后，可見(jiàn)光成像系統(tǒng)在24和48h時(shí)進(jìn)行觀察。分別與20 μmol/L IR-808及DAPI孵育20 min后，近紅外熒光顯微鏡觀察其靶向成像效果。

1.5病理染色

將收集的此例惡性胸水標(biāo)本離心后沉淀浸泡在95%的酒精中，次日進(jìn)行蘇木素與伊紅染色，進(jìn)行細(xì)胞病理學(xué)分析。

2　結(jié)果

2.1近紅外熒光成像系統(tǒng)觀察IR-808對(duì)細(xì)胞的成像結(jié)果

將正常細(xì)胞系293T、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7與一定濃度的近紅外熒光染料IR-808及DAPI孵育，IR-808標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，DAPI主要染細(xì)胞核。近紅外熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像，不同細(xì)胞系的曝光時(shí)間及拍攝條件一致。如圖1所示，IR-808僅靶向腫瘤細(xì)胞成像，而293 T細(xì)胞不成像；且腫瘤細(xì)胞品系之間沒(méi)有明顯差異，均能有較好的近紅外成像效果。

2.2IR-808在正常小鼠及乳腺癌皮下移植瘤模型小鼠體內(nèi)的分布

將生理鹽水及IR-808分別尾靜脈注射入正常小鼠及乳腺癌移植瘤模型小鼠，24 h后觀察染料在小鼠體內(nèi)的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR-808逐漸靶向乳腺癌模型小鼠的腫瘤部位，周圍組織信號(hào)相比腫瘤熒光信號(hào)區(qū)域較低，而正常小鼠沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)的聚集。解剖小鼠，取肝臟、肺、脾臟、心臟、腎臟及腫瘤重要組織器官進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)只有腫瘤組織有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而包括肝、腎在內(nèi)的其他組織無(wú)明顯信號(hào)。離體組織與活體成像結(jié)果基本一致。在觀察期間，小鼠活動(dòng)、反應(yīng)及食欲正常，體質(zhì)量未見(jiàn)減輕，未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)（如圖2～4所示）。

圖1　正常細(xì)胞系293T、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系A(chǔ) 549及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7分別孵育IR-808及DAPI的近紅外顯微鏡觀察結(jié)果

圖2　正常小鼠X線成像及生物熒光成像結(jié)果

圖3　移植瘤小鼠X線成像及生物熒光成像結(jié)果

圖4　動(dòng)物模型組織近紅外成像結(jié)果

2.3IR-808對(duì)惡性胸水標(biāo)本腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果

收集臨床惡性胸水標(biāo)本1例，與20 μmol/L IR-808及DAPI共孵育20 min，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)胸水中腫瘤細(xì)胞的熒光信號(hào)穩(wěn)定性。與IR-808共孵育后的胸水如圖5所示，它顯示出更強(qiáng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，沒(méi)有孵育染料的標(biāo)本并沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生；且24和48 h后其熒光信號(hào)仍然很穩(wěn)定，有利于長(zhǎng)期檢測(cè)。近紅外熒光顯微鏡檢測(cè)胸水標(biāo)本爬片結(jié)果，與DAPI染色結(jié)合，發(fā)現(xiàn)胸水中的腫瘤細(xì)胞被染上，而非腫瘤細(xì)胞沒(méi)有被染上，進(jìn)一步證實(shí)此染料的特異性。細(xì)胞病理染色結(jié)果與染料孵育結(jié)果一致，此染色方法有一定的正確性，其準(zhǔn)確率需較多病例支持并作進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。

圖5　臨床胸水標(biāo)本孵育IR-808后近紅外熒光信號(hào)檢測(cè)結(jié)果

3　討論

目前，生化瑞氏染色和細(xì)胞病理學(xué)診斷是臨床上檢測(cè)胸腹水中癌細(xì)胞最常用的方法。細(xì)胞病理學(xué)診斷以尋找組織碎片、細(xì)胞群、細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及彼此關(guān)系為依據(jù)，對(duì)惡性腫瘤漿膜腔積液中癌細(xì)胞作出早期的診斷，為進(jìn)一步治療提供重要參考。但是針對(duì)某些形態(tài)結(jié)構(gòu)極其相似的細(xì)胞如不典型增生細(xì)胞、組織修復(fù)細(xì)胞和某些良性改變細(xì)胞會(huì)造成假陽(yáng)性診斷，還有不典型組織修復(fù)細(xì)胞，常常出現(xiàn)大核仁、多核仁，偶爾見(jiàn)到核分裂相，其與低分化癌或腺癌鑒別困難，往往誤診或不能確診。此外，對(duì)于某些不明原因引起的胸腹腔積液也不能作出準(zhǔn)確的判斷[7-8]。

NIR熒光成像具有分辨率較高、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、活體無(wú)創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，是最具臨床轉(zhuǎn)化潛力的光學(xué)成像技術(shù)，其近紅外光譜范圍為700～1 000 μm，穿透組織距離可高達(dá)數(shù)厘米，并且不受生物體自發(fā)熒光的干擾，進(jìn)而提高了成像的靈敏度和準(zhǔn)確性[9]。目前，NIR熒光成像研究的熱點(diǎn)是分子探針的開(kāi)發(fā)和制備，其中無(wú)機(jī)熒光分子如量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）及有機(jī)熒光染料吲哚類菁染料如ICG、Cy3、Cy5應(yīng)用最為廣泛[10]。但是這些熒光材料本身不具有腫瘤靶向識(shí)別能力，需通過(guò)化學(xué)連接的方法結(jié)合某些具有腫瘤靶向識(shí)別作用的生物分子，如短肽、RNA或DNA、蛋白質(zhì)和抗體等，制備多功能分子探針。潛在的化學(xué)合成作用可能會(huì)改變某些近紅外染料或腫瘤配體的結(jié)構(gòu)，影響其成像及靶向性能；此外，探針的表面修飾和制備費(fèi)用昂貴，攜帶的重金屬成分具有潛在毒性，因此篩選能直接靶向腫瘤細(xì)胞的小分子熒光化合物迫在眉睫[11]。

最近發(fā)現(xiàn)某些天然NIR熒光染料如IR-780，無(wú)需借助化學(xué)作用，能直接靶向腫瘤近紅外成像。在細(xì)胞水平、腫瘤皮下瘤動(dòng)物模型和腫瘤轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等方面，這一特性均得到驗(yàn)證[12]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織熒光信號(hào)比較，IR-780在腫瘤組織中的熒光信號(hào)強(qiáng)度可提高20倍，傳統(tǒng)生物發(fā)光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)界定熒光信號(hào)比值達(dá)到2.5即具有腫瘤主動(dòng)靶向作用，且在腫瘤組織中可穩(wěn)定存在2周以上，因此此類染料具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，適合體內(nèi)外長(zhǎng)期示蹤、重復(fù)成像[13]。此外，IR-780在體內(nèi)代謝較為穩(wěn)定，能通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)代謝排出體外，生物相容性好，未見(jiàn)明顯的毒副作用。但目前其作用機(jī)制還不是很清楚，此類染料屬于親脂性陽(yáng)離子染料，而腫瘤細(xì)胞中線粒體具有較高的膜電位，染料會(huì)選擇性地聚集在活的腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索[14-15]。

IR-808在IR-780化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，增加了親水性基團(tuán)，無(wú)需有機(jī)溶劑助溶即可在水中溶解，且性能沒(méi)有改變。我們將IR-808分別與正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共孵育，近紅外熒光成像發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)熒光信號(hào)，而正常細(xì)胞無(wú)明顯信號(hào)；在正常小鼠、人乳腺癌動(dòng)物模型體內(nèi)也觀察到IR-808靶向腫瘤近紅外熒光成像的性能，染料尾靜脈注射24 h后開(kāi)始靶向腫瘤成像，且信號(hào)在24及48 h仍然很穩(wěn)定；解剖發(fā)現(xiàn)僅腫瘤組織有信號(hào)，其他重要組織器官無(wú)信號(hào)，得到了較好的預(yù)期結(jié)果?；谏鲜鲅芯砍晒?，我們推測(cè)IR-808也能與胸水中癌細(xì)胞靶向結(jié)合，用靈敏性、特異性更高的近紅外成像方法即可檢出。我們收集臨床上1例惡性胸水標(biāo)本，孵育染料IR-808，發(fā)現(xiàn)其能檢測(cè)到標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞，并結(jié)合病理診斷驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。近紅外花青染料IR-808有可能成為檢測(cè)腫瘤發(fā)生的新指標(biāo)，為惡性腫瘤患者胸水甚至其他體液中腫瘤細(xì)胞的診斷提供一種新方法。

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（收稿：2015-02-03修回：2015-05-12）

Preliminary research on tumor detection by new near-infrared fluorescence dye

TIAN Ying,LU Guang-ming,ZHENG Ling
（Department of Medical Imaging,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command,Nanjing 210002,China）

Objective To explore IR-808 near-infrared fluorescence dye for its in vivo and in vitro application to tumor detection and other clinical application.Methods Human malignant cell lines(colon cancer cell line HCT116,lung cancer cell line A549 and breast cancer cell line MCF-7)were incubated with IR-808 with a concentration of 20 μmol/L for 20 min,and human normal cells embryonic kidney cells(293T)were used as control.The subcutaneous tumor xenografts models were established by bearing human breast cancer cells,the imaging effect was observed 24 h after i.v injection of IR-808 at the dose of 1 mg/kg.One malignant pleuroperitoneal effusion sample was collected and incubated with IR-808 at the same concentration 24 and 48 h after,and then the stability of fluorescence signal and the tumor imaging effect were detected subsequently.Results The targeted imaging performance to cancer cells using IR-808 was confirmed in vitro and in vivo,and the fluorescence signal was very stable.Cancer cells in clinical effusion incubation with IR-808 were also detected.Conclusion IR-808 exhibits the property of tumor targeted imaging,which could be further used to detect tumor cells in clinical samples.So IR-808 will have great potential application in the future.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（10）：24-26，29]

near-infrared fluorescence dye IR-808;tumor;targeting imaging

[中國(guó)圖書(shū)資料分類號(hào)]R318；R730.4A

1003-8868（2015）10-0024-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.10.024

田迎（1983—），女，技師，主要從事分子影像與分子病理學(xué)方面的研究工作，E-mail：ty52111@sina.com。

210002南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科（田迎，盧光明，鄭玲）

鄭玲，E-mail：cjr.zhengling@vip.163.com