付佩彩 黃珊珊 唐榮華 趙東明

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院:1神經(jīng)內(nèi)科;2骨科，武漢 430030)

少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞，約占成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中所有膠質(zhì)細(xì)胞的5%－8%。OPCs細(xì)胞形態(tài)為雙極、三級(jí)或多級(jí)，其特異性標(biāo)記物為 NG2+A2B5［1］。OPCs持續(xù)存在于成年CNS中，為處于早期分化的未成熟細(xì)胞，在缺血缺氧等導(dǎo)致的脫髓鞘損傷后，少突膠質(zhì)前體OPCs活化增殖，遷移至損傷處，分化形成少突膠質(zhì)細(xì)胞(OL)，進(jìn)而形成髓鞘，完成髓鞘再生過程［2，3］。最新的研究證實(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞還具有供給神經(jīng)元能量的功能，在生理狀態(tài)下，少突膠質(zhì)細(xì)胞能代謝轉(zhuǎn)運(yùn)乳酸為神經(jīng)元提供能量支持，幫助神經(jīng)元的存活［4，5］。因此，少突膠質(zhì)細(xì)胞的病理改變不僅可引起CNS廣泛的脫髓鞘病變，而且也極可能參與以神經(jīng)元軸突缺失和神經(jīng)性萎縮為特性的神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)采用震搖、差速貼壁法培養(yǎng)高純度OPCs，并進(jìn)一步觀察其分化為OL能力并建立OGD模型，以期為探討神經(jīng)退行性病變發(fā)病機(jī)制建立進(jìn)一步試驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1.動(dòng)物與試劑

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠乳鼠購(gòu)自華中科技大同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清、DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)液、N2 supplement(100×)、胰蛋白酶、B27 supplement(50×)、DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;T3購(gòu)自invitrogen公司;多聚賴氨酸(polylysine，PLL)、DAPI試劑購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;Rat CNTF、Rat FGF Basic、Human PDGF－AA 購(gòu)自 Peorotech公司。兔抗NG2購(gòu)自美國(guó)neuromarker公司;鼠抗A2B5購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;Edu試劑盒購(gòu)自上海銳博公司;CY3標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。

2.混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

出生3d內(nèi)SD大鼠乳鼠經(jīng)75%乙醇消毒后，用眼科剪和眼科鑷取腦，在PBS液中充分漂洗;把腦剔除腦膜后，腦組織用眼科剪剪成小塊，置于37℃0.125%胰酶中消化10 min;含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，用巴氏管反復(fù)吹打腦組織使其分散成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液用200目的篩網(wǎng)過濾;過濾后的懸液置4℃的低溫離心機(jī)中以800 r/min的速度離心8 min。棄去上清液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于用多聚賴氨酸預(yù)包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(T75)中;置于普通細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)，培養(yǎng)第3天將培養(yǎng)基更換為含20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，之后每3－4天換液一次;直至混合膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底(約10d)。

3.OPCs分離純化培養(yǎng)及鑒定

待混合膠質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶瓶底后，擰緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，并用封口膠封閉瓶口。將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床振搖，設(shè)參數(shù)為180 r/min，先預(yù)振搖2h，然后棄上清，更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃恒溫?fù)u床振搖，參數(shù)不變，振搖15－18h;后轉(zhuǎn)移振搖后的細(xì)胞上清，種于未包被的100 mm培養(yǎng)皿中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，使其靜置貼壁1h，吸取上清，此步驟可進(jìn)一步去除小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞;收集上清于離心管中離心(800 r/min×8 min)，棄去上清，用 OPCs培養(yǎng)基(含 10ng/ml PDGF－AA、10ng/ml FGF Basic、1×N2、1×B27的DMEM/F12培養(yǎng)基)重懸后，種于含有PLL預(yù)包被的蓋玻片的24孔板及96孔板中。

OPCs隔天換液，培養(yǎng)3d后換用OL分化培養(yǎng)基(含 10ng/ml CNTF、50ng/ml T3、1 × N2、1 × B27 的DMEM/F12培養(yǎng)基)以分化培養(yǎng)OL及進(jìn)行MTT及EdU檢測(cè)。

4.OGD干預(yù)

OPCs純化培養(yǎng)3d后，將細(xì)胞分為Control組及OGD組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中Control組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)換用新鮮培養(yǎng)液，OGD組換用無糖培養(yǎng)液，OGD在含1%O2，5%CO2，37℃條件下培養(yǎng) 0.5h、1h、2h 及 4h。

5.免疫熒光染色

將24孔板中細(xì)胞爬片在干預(yù)各時(shí)間點(diǎn)吸除原培養(yǎng)基，用PBS漂洗3次，后用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30min，吸除固定液，PBS漂洗3次，用含0.2%triton－X100的PBS室溫破膜15min，吸除破膜液后PBS漂洗3次，BSA封閉1h后，加入預(yù)先用抗體稀釋液稀釋的對(duì)應(yīng)一抗(anti－NG2、anti－A2B5 和 anti－MBP)4℃封閉過夜。PBS清洗，加入對(duì)應(yīng)二抗(FITC羊抗鼠IgG、CY3羊抗兔IgG)避光條件下室溫孵育1h。棄二抗，漂洗后DAPI染核8min，PBS漂洗3次，用50%甘油封片，各爬片在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

6.MTT測(cè)定細(xì)胞活力

震搖純化后 OPCs離心重懸，調(diào)整密度至1×106/ml，每孔加入 200μl至 96孔板中，培養(yǎng) 3d后，按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)分別換成相應(yīng)培養(yǎng)基，每組分別設(shè)8個(gè)平行孔，在各時(shí)間點(diǎn)吸除上清，每孔分別加入 50μL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)，4h后吸除MTT，每孔加入DMSO 100μl，充分振蕩，使紫色結(jié)晶物溶解，最后在酶標(biāo)儀上以490nm波長(zhǎng)測(cè)取每孔的吸光度值(OD490)。

7.EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖

將OPCs調(diào)整密度至1×106/m l，接種于含有PLL預(yù)包被的蓋玻片的24孔板，每孔500μl，培養(yǎng)3d后，按照實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)分別換成相應(yīng)培養(yǎng)基。在各時(shí)間點(diǎn)前2小時(shí)加入50μM EdU培養(yǎng)基，分別在各設(shè)定時(shí)間點(diǎn)漂洗細(xì)胞后加入細(xì)胞固定液。按EdU試劑盒說明書進(jìn)行染色，染色成功后照相。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.OPCs的鑒定及分化

原代培養(yǎng)的OPCs細(xì)胞多為雙極性，少數(shù)為3極或多極。將OPCs做NG2+A2B5免疫熒光染色，結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的OPCs 95%以上表達(dá)OPCs特異性標(biāo)記物NG2+A2B5(圖1A)。進(jìn)一步分化試驗(yàn)顯示，原代培養(yǎng)的OPCs可分化為MBP陽性的OL細(xì)胞(圖1B)。

2.M TT檢測(cè)OPCs的活力

與Control組相比，OGD組細(xì)胞活力在0.5h無明顯改變，在干預(yù)1h及2h時(shí)細(xì)胞活力降低;其中在干預(yù)2h時(shí)細(xì)胞活力降低明顯，干預(yù)4h時(shí)細(xì)胞活力降低更加顯著(P＜0.05)(圖2)

3.EdU檢測(cè)OGD不同時(shí)間點(diǎn)OPCs增殖

OGD組干預(yù)后1h，2h及4h時(shí)EdU陽性率較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，干預(yù)0.5h時(shí)各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

圖1 OPCs特異性鑒定分化:A1為NG2染色陽性，A2為細(xì)胞核A2B5染色陽性，A3為A1與A2及DAPI的合成圖;B1為MBP染色陽性，B2為細(xì)胞核DAPI染色，B3為B1與B2的合成圖。Bar=25μmFig.1 The specific identification of OPCs and OL:A1:NG2 positive staining，A2:A2B5 positive nuclear staining，A3:DAPIstainingmerged with A1 and A2;B1:MBP positive staining，B2:DAPIstaining，B3:B1 and B2 merged figure

圖2 不同干預(yù)組OPCs的MTT檢測(cè)統(tǒng)計(jì)圖.*P＜0.05Fig.2 The statistical figure of MTT test of OPCs by different intervention.*P＜0.05

圖3 不同干預(yù)組EdU陽性率檢測(cè)結(jié)果 A為Control組EdU陽性率(A1為EdU著色，A2為DAPI，A3為合成圖);B為OGD2h組EdU陽性率(B1為EdU著色，B2為DAPI，B3為合成圖);C各組EdU陽性細(xì)胞率的統(tǒng)計(jì)圖(*P＜0.05)Fig.3 Results of EdU positive staining rate in different groups A:EdU positive staining in the Control group(A1:EdU staining，A2:DAPIstaining，A3:A1 and A2 merged);B:EdU positive staining in 2h OGD group(B1:EdU staining，B2:DAPIstaining，B3:A1 and A2 merged;C:The statistical figure of EdU positive rate by different intervention(*P＜0.05)

討 論

顱腦缺血性損傷(卒中)、脊髓損傷、腦室周圍白質(zhì)軟化以及多發(fā)性硬化等多種CNS疾病均可導(dǎo)致OL大量死亡，引發(fā)廣泛的脫髓鞘病變，造成神經(jīng)功能損傷［6－8］。目前諸多研究已證實(shí)少突膠質(zhì)細(xì)胞功能失調(diào)參與了許多神經(jīng)退行性疾病的致病，以肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)為代表的遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變疾病中，少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)異常改變遠(yuǎn)早于疾病的發(fā)生并且疾病的發(fā)展最終導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡［9］。成熟的OL自身不可再生修復(fù)，其再生依賴于OPCs的增殖分化［10］。OPCs在鼠類胚胎期E 14.5d出現(xiàn)，在成熟中樞神系統(tǒng)中持續(xù)存在，在脫髓鞘損傷后，OPCs可遷移并分化為成熟OL，促進(jìn)髓鞘修復(fù)。因此，OPCs的體外培養(yǎng)對(duì)研究脫髓鞘疾病及神經(jīng)退行性病變具有重要價(jià)值。

目前報(bào)道的OPCs培養(yǎng)方法包括切片培養(yǎng)法、免疫抗體包被篩選法、振搖法、神經(jīng)球誘導(dǎo)分化法等［11－13］。上述方法像切片培養(yǎng)法主要用于原位研究OPCs細(xì)胞行為學(xué)，不是以擴(kuò)增和純化為目的的培養(yǎng);免疫抗體包被篩選法耗費(fèi)抗體多，實(shí)驗(yàn)成本大;而神經(jīng)球誘導(dǎo)分化法容易出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元等雜細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用改良振搖法可避免上述耗費(fèi)成本高等缺陷，且一次培養(yǎng)混合細(xì)胞可振搖后重新培養(yǎng)，可重復(fù)振搖2－3次，細(xì)胞純度達(dá)到95%以上，且可同時(shí)得到純度較高的小膠質(zhì)細(xì)胞，可用于需要大量細(xì)胞的試驗(yàn)。然而，在分離培養(yǎng)OPCs過程中，有下列幾點(diǎn)需要注意:(1)取材需把標(biāo)本置于冰上進(jìn)行，這樣可最大限度保持細(xì)胞的活性。(2)控制好胰酶消化的時(shí)間，限定在10min左右。(3)振搖法的過程設(shè)計(jì)的選擇是根據(jù)細(xì)胞貼壁牢固程度確定的，懸液中各種細(xì)胞貼壁牢固程度從大到小排序?yàn)樾切文z質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞。預(yù)搖2h首先可將部分小膠質(zhì)細(xì)胞去除，振搖15－18h后OPCs可從貼壁的混合膠質(zhì)細(xì)胞層搖下，此時(shí)收集細(xì)胞上清，再行貼壁培養(yǎng)1h，然后取細(xì)胞上清，此步驟可進(jìn)一步去除殘留的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，這是因?yàn)槿N細(xì)胞中，OPCs的貼壁時(shí)間最長(zhǎng)。(4)振搖時(shí)封閉培養(yǎng)瓶瓶口的目的是創(chuàng)造缺氧環(huán)境，該環(huán)境有利于OPCs分離進(jìn)入懸液中。(5)振搖和貼壁要嚴(yán)格把握參數(shù)和時(shí)間，否則影響OPCs的純度和獲得細(xì)胞量。

近年來，神經(jīng)細(xì)胞體外缺氧培養(yǎng)的同時(shí)合并培養(yǎng)基缺糖已被公認(rèn)為模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷合適的模型。關(guān)于OPCs缺血缺氧損傷的體外試驗(yàn)較少，文獻(xiàn)中OGD干預(yù)時(shí)間及氧濃度不等，其中干預(yù)時(shí)間主要為 0.5 －2h［14－16］。本試驗(yàn)中，我們通過對(duì) OPCs 糖氧剝奪后，使用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力以及EdU試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，OGD干預(yù)0.5h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖均無明顯差別。干預(yù)1h、2h及4h后，與對(duì)照組相比，OPCs細(xì)胞活力及細(xì)胞增殖均有下降(P＜0.05)，其中干預(yù)2h時(shí)，MTT下降明顯，細(xì)胞增殖減低約為40－50%，故我們考慮2h可作為OPCs體外糖氧剝奪模型合適的試驗(yàn)損傷時(shí)間，干預(yù)4h時(shí)，細(xì)胞損傷明顯，故不再延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間。

綜上所述，本文中我們采用震搖、差速貼壁法培養(yǎng)出高純度的OPCs，且培養(yǎng)的OPCs具有分化成為OL的能力。2h可作為OPCs體外OGD模型建立的合適時(shí)間。

［1］McCarthy KD，de Vellis J.Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.J Cell Biol，1980，85(3):890－902

［2］Vitry S，Avellana－Adalid V，Lachapelle F，et al.Migration and multipotentiality of PSA－NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain.Mol Cell Neurosci，2001，17(6):983－1000

［3］Cai J1，Qi Y，Hu X，et al.，Generation of oligodendrocyte precursor cells from mouse dorsal spinal cord independentof Nkx6 regulation and Shh signaling.Neuron，2005，45(1):41－53

［4］ van der Burg JM，Bj?rkqvist M，Brundin P.Beyond the brain:widespread pathology in Huntington’s disease.Lancet Neurol，2009，8(8):765－774

［5］Bradford J，Shin JY，Roberts M，et al.Expression ofmutant huntingtin in mouse brain astrocytes causes age－dependent neurological symptoms.Proc Natl Acad Sci U SA，2009，106(52):22480－22485

［6］Kessaris N，F(xiàn)ogarty M，Iannarelli P，et al.Competing waves of oligodendrocytes in the forebrain and postnatal elimination of an embryonic lineage.Nat Neurosci，2006，9(2):173－179

［7］ Miller，R.H.Regulation of oligodendrocyte development in the vertebrate CNS.Prog Neurobiol，2002，67(6):451－467

［8］Noble M，F(xiàn)ok－Seang J，Wolswijk G，et al.，Development and regeneration in the central nervous system.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，1990，327(1239):127－143

［9］ Philips T，Bento－Abreu A，Nonneman A.Oligodendrocyte dysfunction in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis.Brain，2013，136(Pt2):471－482

［10］Labombarda F，González S，Lima A，et al.Progesterone attenuates astro－ and microgliosis and enhances oligodendrocyte differentiation following spinal cord injury.Exp Neurol，2011，231(1):135－146

［11］Chen Y，Balasubramaniyan V，Peng J，et al.Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.Nat Protoc，2007，2(5):1044－1051

［12］Hu J，Deng L，Wang X，et al.Effects of extracellularmatrix molecules on the growth properties of oligodendrocyte progenitor cells in vitro.J Neurosci Res，2009，87(13):2854－2862

［13］Tsai HH1，Macklin WB，Miller RH.Distinctmodes ofmigration position oligodendrocyte precursors for localized cell division in the developing spinal cord.J Neurosci Res，2009，87(15):3320－3330

［14］Fu P，Tang R1，Yu Z，et al.Bumetanide－induced NKCC1 inhibition attenuates oxygen－glucose deprivation－induced decrease in proliferative activity and cell cycle progression arrest in cultured OPCs via p－38 MAPKs.Brain Res，2015，1613:110－119

［15］Wu X，Qu X，Zhang Q，et al.Quercetin promotes proliferation and differentiation of oligodendrocyte precursor cells after oxygen/glucose deprivation－induced injury.Cell Mol Neurobiol，2014，34(3):463－471

［16］Wang XQ，Yao RQ，Liu X，et al.Quercetin protects oligodendrocyte precursor cells from oxygen/glucose deprivation injury in vitro via the activation of the PI3K/Akt signaling pathway.Brain Res Bull，2011，86(3－4):277－284