何展文 劉木金 孟 哲 李平甘 羅向陽 李棟方 梁立陽

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科 廣州 510120

炎癥性脫髓鞘疾病是以神經(jīng)髓鞘脫失為主要或始發(fā)病變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近來研究顯示軸索損害和神經(jīng)功能損傷同樣參與其病理生理過程，而且可能是疾病后期導(dǎo)致持續(xù)不可逆神經(jīng)功能障礙的主要原因［1-2］。如何能取得更滿意的治療效果，治療上不僅需要免疫調(diào)節(jié)，更需要神經(jīng)保護(hù)再生治療。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）不僅具有免疫調(diào)節(jié)功能，而且具有多向分化能力，可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，為細(xì)胞移植治療炎癥性脫髓鞘疾病開拓了新道路。本實驗研究擬在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）大鼠模型免疫后早期靜脈輸注BMSCs，觀察輸注后大鼠臨床癥狀和神經(jīng)功能變化，利用免疫組化方法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、2’，3’-環(huán)腺苷酸-3’-磷酸二酯酶（CNPase）表達(dá)，觀察移植后的BMSCs在EAE 大鼠體內(nèi)存活、增殖、分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞情況，了解BMSCs對EAE的神經(jīng)再生的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康雌性SD 大鼠，體質(zhì)量190～220g，購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，合格證號：廣東省實驗動物檢測所合格證2008-0002號。本校北校區(qū)動物實驗中心按SPF級飼養(yǎng)，環(huán)境溫度25 ℃，濕度70%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，除實驗時間外，可自由攝食和飲水。健康Wistar大鼠，200g左右，購自中山大學(xué)實驗動物中心，合格證號：廣東省實驗動物檢測所合格證2008-0562號。

1．2 主要實驗材料 胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胰蛋白酶購置上海吉泰科技有限公司。FITC mouse IgG1 購 自BD pharmingen 公 司；Mouse anti-rat CD44、PE anti-rat CD3、PE mouse IgG1、PE anti-rat CD4、PE anti-rat CD8、PE anti-mouse／rat CD25 購 自Serotec 公 司；FITC anti-rat CD90、PE anti-rat CD106、PE anti-rat CD45、PE mouse IgG2a、PE anti-rat CD11b／c、PE Armenlan Hamster和PE anti-mouse／rat CD29 購 自Biolegend 公 司；CD34 PE 購 自Santa Cruz Biotechnology 公 司。MBP68-86（bs-0380p）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。完全佐劑購自廣州捷倍斯生物科技有限公司。百日咳疫苗購自河北石家莊偉天科學(xué)儀器設(shè)備有限公司。NSE 鼠多克隆抗體、GFAP鼠多克隆抗體、CNPase鼠多克隆抗體購自英國Abcam 公司。SA1022 兔IgG 試劑盒、SA1021 小 鼠IgG 試劑盒 和AR1022DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 BMSCs的分離培養(yǎng)和表型鑒定 斷頸處死Wistar大鼠，放置超凈臺上，剪開大鼠后肢皮膚，充分暴露剝離腿部肌肉，取出股骨和脛骨。剪去其兩端骨骺，于10cm2培養(yǎng)皿內(nèi)使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液沖洗骨髓。用骨髓間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打使之形成單細(xì)胞懸液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。貼壁3d后換液，每隔3d換液直至傳代，待細(xì)胞80%～90%融合的時候傳代，第4代（P4）用于實驗。用0．25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞移入離心管中，1 100r／min離心4min，棄去上清。加PBS溶液重懸細(xì)胞，吸取100μL 細(xì)胞懸液（約3．0×105個細(xì)胞）加入EP管內(nèi)。按量加入與PE或FITC標(biāo)記的IgG1、CD34、CD44、CD45、CD11b／c、CD29、CD90、CD105單克隆抗體，避光孵育30min，上機檢測。

1．4 方法

1．4．1 實驗分組：SPF 級SD 大 鼠45 只，按體質(zhì)量大小編號，隨機分為3組，分別為EAE模型組、正常對照組、EAE模型BMSCs移植組。EAE模型組：每只大鼠用10%水合氯醛按體質(zhì)量0．3mL／100g經(jīng)腹腔注射麻醉至四肢松弛，75%酒精消毒足墊，四足墊皮下注射含有100μg（0．4 mL）的MBP68-86-CFA 混合免疫乳劑，免疫當(dāng)日及2d后分別在兩側(cè)腹股溝皮下注射百日咳疫苗0．1mL（約1×109個菌體）；免疫當(dāng)天分別在尾靜脈靜注0．4mL等量生理鹽水。以免疫當(dāng)天為第0天。正常對照組：方法和步驟同上，但免疫誘導(dǎo)劑采用生理鹽水制成的混合乳劑，注射后當(dāng)日及2d后分別在兩側(cè)腹股溝皮下注射0．1 mL 生理鹽水。EAE 模型BMSCs移植組：采用上述方法建立EAE 模型，免疫后第5天在尾靜脈靜注CFSE標(biāo)記后BMSCs（4×106／只，0．4mL），大鼠共20只，隨機分為4組，分別在移植后第7天、15天、21天及30天處死。

1．4．2 神經(jīng)功能評價：免疫后所有動物每天稱體質(zhì)量并進(jìn)行神經(jīng)功能評分：0分：正常；1分：鼠尾張力障礙；2分：部分后肢癱瘓或步態(tài)不穩(wěn)；3分：完全后肢癱瘓；4分：完全后肢癱瘓加部分或完全前肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡；癥狀介于兩條標(biāo)準(zhǔn)之間者用±0．5分表示。

1．4．3 免疫組織化學(xué)檢測：各組大鼠按相應(yīng)的時間點以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用100mL 預(yù)冷的多聚甲醛經(jīng)主動脈灌流至無血液流出時，小心取出脊髓及腦組織于10%福爾馬林中保存。冠狀位切取小段頸髓及部分腦組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。分別進(jìn)行NSE、GFAP、CNPase免疫組織化學(xué)檢測，觀察輸注后大鼠腦內(nèi)及脊髓處的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)情況。組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換后再PBS浸泡10min；無水乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min；90%乙醇中浸泡5min；80%乙醇中浸泡5min；70%乙醇中浸泡5min；蒸餾水中浸泡5min。用3%H2O2，室溫封閉10min，蒸餾水洗3次，PBS洗2次。滴加5%BSA 封閉液，室溫20min，甩去多余液體。滴加NSE（1∶100）、GFAP（1∶4 000）和CNPase（1∶1 600）一抗，4℃過夜，PBS洗3次。滴加相應(yīng)的生物素化二抗，37 ℃20min，PBS洗3次。滴加鏈霉素化親和素試 劑，37 ℃20 min，PBS 洗4 次。DAB 顯色試劑盒顯色。蘇木素復(fù)染2 min、飽和磷酸氫二鈉分化。脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒的為陽性細(xì)胞。每張切片選擇10個表達(dá)最強的視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)后取平均值。

1．4．4 腦和脊髓的病理組織學(xué)檢查：動物處死后，取腦室周圍及脊髓腰膨大部位組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片5μm 厚，行HE染色和髓鞘染色，并在光鏡下進(jìn)行組織學(xué)評分，0：無炎癥變化；1：炎癥細(xì)胞浸潤僅限于血管周圍和脊膜周圍；2：脊髓內(nèi)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤（1～10個細(xì)胞／片子）；3：脊髓內(nèi)中度的炎癥細(xì)胞浸潤（11～100個細(xì)胞／片子）；4：脊髓內(nèi)嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤（＞100個細(xì)胞／片子）。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準(zhǔn)α＝0．05，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 BMSCs分離培養(yǎng)與表型鑒定結(jié)果 原代培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞接種第3天，部分貼壁生長，多呈長梭形、三角形和多角形，即為BMSCs；于第7～12天開始增長明顯加快，具有一定的方向性，呈束狀或放射狀排列；第14天左右，單種細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞貼壁率達(dá)90%。傳代培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)多為長梭形，較原代細(xì)胞體積增大，增殖速度加快，貼壁能力增強，約7d貼壁率達(dá)80%～90%。通過流式檢測第4代Wistar大鼠BMSCs的表型，結(jié)果顯示：強 表 達(dá)CD29、CD44 和CD90，少量表達(dá)CD34 和CD106，幾乎不表達(dá)CD11b 和CD45。

2．2 BMSCs對EAE大鼠神經(jīng)功能評分的影響 所有EAE模型大鼠未治療時均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神反應(yīng)欠差，活動及進(jìn)食減少，體質(zhì)量下降，毛發(fā)疏松或脫毛，失去光澤，全身縮成一團(tuán)，弓背，腹脹，尾巴無力，后肢、前肢、偏癱或全身癱瘓，部分出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，瀕死甚至死亡。我們在免疫后第5天靜脈輸注BMSCs，BMSCs移植組大鼠高峰期評分及整個病程的平均評分較EAE模型組顯著降低（P＜0．05）（表1），且發(fā)病時間延遲，發(fā)病率降低。

2．3 免疫組織化學(xué)檢測 EAE 模型組和BMSCs移植組NSE陽性細(xì)胞較正常對照組明顯減少，其中在移植后第15天和第21天減少最明顯（P＜0．05）。BMSCs移植組在第7天陽性細(xì)胞數(shù)較EAE 模型組表達(dá)水平增多，但并無顯著性差異，而第15天、第21天和第30天NSE陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于EAE模型組的表達(dá)水平（P＜0．05）（表2、圖1）。各個時間點GFAP陽性細(xì)胞數(shù)無論是EAE 模型組還是BMSCs移植組，與正常對照組的表達(dá)水平并無顯著性差異（表3、圖2）。EAE模型組CNPase染色陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組明顯減少（P＜0．05）。BMSCs移植組在第7天陽性細(xì)胞數(shù)較正常對照組表達(dá)水平降低（P＜0．05），隨著時間遷移，BMSCs移植組CNPase染色陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)逐漸增加，各時間點CNPase染色陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于EAE 模型組的表達(dá)水平（P＜0．05）（表4、圖3）。

2．4 BMSCs對EAE腦脊髓病理檢查的影響 腦脊髓病理檢查示EAE組大鼠腦和脊髓內(nèi)多處血管“袖套”樣改變，表現(xiàn)為血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，神經(jīng)元變性，部分出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)。BMSCs移植組與EAE 模型組比較，各時間點病理示炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，脫髓鞘改變也顯著減輕，神經(jīng)元變性數(shù)目明顯減少。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分

表2 不同時間大鼠腦組織切片NSE染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s，n＝5）

表2 不同時間大鼠腦組織切片NSE染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s，n＝5）

注：EAE group 比 較，＊ P ＜0．05，與Negative control group，△P＜0．05

組別7d 15d 21d 30d EAE group 14．63±6．36△ 8．34±4．22△ 6．25±2．59△ 6．85±3．25△Negative control 24．37±4．12 BMSCs group 17．28±4．62 15．47±3．78△16．78±4．59＊△18．41±4．25＊

圖1 NSE在大鼠腦中表達(dá)情況

表3 不同時間大鼠腦組織切片GFAP染色陽性細(xì)胞數(shù)比例 （±s，n＝5）

表3 不同時間大鼠腦組織切片GFAP染色陽性細(xì)胞數(shù)比例 （±s，n＝5）

組別7d 15d 21d 30d EAE group 15．31±4．08 16．19±3．84 15．87±3．53 15．01±4．3 5 Negative control 14．48±3．53 BMSCs group 13．73±4．66 14．53±2．99 15．45±4．55 16．09±3．2 2

圖2 GFAP在大鼠腦中表達(dá)情況

表4 不同時間大鼠腦組織切片CNPase染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s，n＝5）

表4 不同時間大鼠腦組織切片CNPase染色陽性細(xì)胞數(shù)比較 （±s，n＝5）

注：與EAE group 比 較，＊P＜0．05，與Negative control group比較，△P＜0．05

組別7d 15d 21d 30d EAE group 10．66±4．53△ 11．87±4．0△ 10．27±3．97△ 12．47±3．29△Negative control 22．65±5．79 BMSCs group 16．35±4．74△ 19．25±3．95＊ 20．21±4．32＊ 25．43±5．04＊

圖3 CNPase在大鼠腦中表達(dá)情況

3 討論

炎癥性脫髓鞘疾病本身可能是炎癥反應(yīng)和神經(jīng)退行性損傷的參與發(fā)病過程。炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和軸突損害是中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性脫髓鞘疾病三個重要病理改變。炎癥反應(yīng)導(dǎo)致脫髓鞘改變，炎癥反應(yīng)和髓鞘破壞損傷軸突，最終導(dǎo)致神經(jīng)退行性損傷。目前對于炎癥性脫髓鞘疾病主要是免疫調(diào)節(jié)治療，但由于缺乏有效髓鞘再生機制，軸突損害或神經(jīng)元不可逆的損傷，導(dǎo)致其治療效果往往并不理想。近年來，不少神經(jīng)病學(xué)學(xué)者致力研究脫髓鞘疾病神經(jīng)損傷機制及如何促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)再生，發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞生物治療可以改善局部損傷微環(huán)境，從而促進(jìn)髓鞘或神經(jīng)再生，促進(jìn)形成新的突觸聯(lián)系和信息傳導(dǎo)恢復(fù)。

BMSCs作為骨髓造血干細(xì)胞的基質(zhì)支持細(xì)胞，是一群多功能的干細(xì)胞，在特定的培養(yǎng)條件下分化為骨、脂肪、軟骨和肌肉等結(jié)締組織，也可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。Priller等［3］在大鼠紋狀體注射人BMSCs細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)有20%移植的細(xì)胞能長時間在大鼠腦中存活并廣泛分布于腦中，遷移路徑和神經(jīng)干細(xì)胞及星形細(xì)胞的遷移路徑相同；同時移植后BMSCs失去BMSCs在培養(yǎng)中的典型特征而表現(xiàn)許多神經(jīng)細(xì)胞的特征。Akiyama等［4］在脊髓損傷大鼠動物模型通過靜脈輸注BMSCs能顯著改善脊髓損傷后髓鞘再生。同樣Satake等［5］在脊髓橫斷損傷動物模型中鞘內(nèi)注射BMSCs也能促進(jìn)脊髓損傷后髓鞘再生和運動功能恢復(fù)。研究結(jié)果表明，BMSCs生物治療有利于神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病修復(fù)，顯示出可觀的神經(jīng)再生可塑性。本實驗在EAE 免疫后早期靜脈輸注CFSE標(biāo)記的BMSCs，觀察輸注后大鼠神經(jīng)功能變化及病變部位的標(biāo)記細(xì)胞分布，利用免疫組化方法檢測NSE、GFAP、CNPase表達(dá)，觀察BMSCs移植后EAE 大鼠體內(nèi)神經(jīng)元（NSE）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP）和少突膠質(zhì)細(xì)胞（CNPase）數(shù)量，了解BMSCs對EAE 的神經(jīng)再生的修復(fù)作用及遷徙分化情況。

本實驗中采用NSE、GFAP、CNPase抗體均為小鼠抗大鼠抗體，具有高度特異性，分別檢測移植后不同時間點神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)情況，結(jié)果顯示在EAE模型組，NSE 和CNPase的表達(dá)較正常對照組顯著下降，提示在EAE模型中可能存在不同程度神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷凋亡。目前研究顯示在EAE 和MS的病灶內(nèi)存在少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞的凋亡，并在疾病的發(fā)病和病情發(fā)展中有重要的作用［6］。少突膠質(zhì)細(xì)胞是髓鞘形成細(xì)胞，具有形成和修復(fù)髓鞘的能力，影響軸突的生長、結(jié)構(gòu)以及功能。少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡影響髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能，引起髓鞘脫失，繼發(fā)或加重軸突的損傷［7］。

研究顯示，BMSCs植入實驗動物體內(nèi)后具有增殖、遷徙和分化的能力，可調(diào)節(jié)EAE 大鼠的免疫紊亂并分化為髓鞘形成細(xì)胞，刺激髓鞘再生，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)。關(guān)于BMSCs在炎癥性脫髓鞘疾病中神經(jīng)再生保護(hù)的機制尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能與下列幾種因素有關(guān)：（1）BMSCs植入體內(nèi)能向損傷處遷徙并向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化并替代死亡的宿主細(xì)胞，與局部殘存的細(xì)胞重新建立聯(lián)系，恢復(fù)神經(jīng)元回路［8-9］。（2）BMSCs可分泌多種細(xì)胞因子及神經(jīng)生長因子，改善局部微環(huán)境并啟動再生相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)軸突功能的再生［10-11］。Bianco等［12］將BMSCs植入動物體內(nèi)后，可導(dǎo)致IL-6、IL-7、IL-12和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）等多種細(xì)胞因子分泌增多，這些細(xì)胞因子對神經(jīng)損傷修復(fù)起重要作用，同樣可能對免疫調(diào)控起一定作用。（3）BMSCs能夠抑制神經(jīng)元的凋亡，并使殘存的脫髓鞘的神經(jīng)纖維和新生的神經(jīng)纖維髓鞘化，從而恢復(fù)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的完整性［8，13-14］。

綜上，預(yù)防給予BMSCs可以明顯改善EAE大鼠神經(jīng)缺損癥狀及縮短病程，可能機制是通過免疫調(diào)節(jié)，抑制免疫反應(yīng)所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，減少神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但不能排除仍有部分BMSCs在局部微環(huán)境信號的誘導(dǎo)下向脫髓鞘區(qū)遷徙并分化為髓鞘形成細(xì)胞的可能。本研究為BMSCs在臨床上炎癥性脫髓鞘疾病治療提供了理論依據(jù)。

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