畢生雷，張成明，金洪波，鄭世文，劉鉞，杜風(fēng)光

1(河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽(yáng)，473000)

2(清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院，北京，100084)

3(北京市生物燃料工程技術(shù)研究中心，北京，100084)

小球藻(Chlorella)異養(yǎng)培養(yǎng)具有生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵設(shè)備通用性好，占地面積少，培養(yǎng)過程和藻細(xì)胞采收成本低，勞動(dòng)強(qiáng)度低等特點(diǎn)，近年來受到廣泛關(guān)注。通過對(duì)高細(xì)胞濃度異養(yǎng)培養(yǎng)技術(shù)的研究與探索，大幅度提高了小球藻發(fā)酵效率，使小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能［1－3］。ZHENG 等發(fā)現(xiàn)，小球藻在兩級(jí)異養(yǎng)培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)速度、細(xì)胞密度分別為光自養(yǎng)條件下的3.0和3.3倍［4］。Ceron-Garcia等人在2 L發(fā)酵罐中進(jìn)行小球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)，最終得到的細(xì)胞干重達(dá)64 g/L，日干重增加量達(dá)到8.7 g/(L·d)，且藻細(xì)胞中油脂含量達(dá)到50%［5］。CHEN等使用葡萄糖作為碳源進(jìn)行小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)，生物質(zhì)和脂質(zhì)的葡萄糖轉(zhuǎn)換率分別為 43.3%和 14.2%［6］。Isleten-Hosoglu等人報(bào)道，異養(yǎng)小球藻脂肪酸的主要成分為油酸(C18∶1)和亞油酸(C18∶2)，它們分別占總脂肪酸含量的34.4%和30.1%［7］。在高密度培養(yǎng)方面，華東理工大學(xué)李元廣教授報(bào)道異養(yǎng)小球藻的培養(yǎng)密度高可達(dá)140 g/L、日產(chǎn)率可達(dá)9.08 g/(L·d)，是目前的最高水平［8］。而且，異養(yǎng)與光自養(yǎng)串聯(lián)培養(yǎng)后異養(yǎng)小球藻日產(chǎn)率可達(dá)15 g/(L·d)，折合后單位面積日產(chǎn)率是自養(yǎng)培養(yǎng)的101～140倍［8］。

小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的發(fā)酵周期通常長(zhǎng)達(dá)7～15 d，生長(zhǎng)速度較慢，如果培養(yǎng)措施不當(dāng)，則很容易被細(xì)菌、霉菌等環(huán)境中存在的微生物污染［9］。環(huán)境中霉菌的存在是由于空氣、設(shè)備、墻壁等存在潮濕的狀況，而小球藻在培養(yǎng)過程中一般不會(huì)受到霉菌污染。錢文倩等認(rèn)為，小球藻培養(yǎng)過程中污染菌主要是芽孢屬桿菌［10］。在受到外來菌污染后，小球藻生長(zhǎng)受到抑制，藻細(xì)胞內(nèi)脂類含量下降，為無菌條件下的86%［10］。目前小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)染菌后通常的做法是停止發(fā)酵、徹底殺菌，這樣會(huì)造成培養(yǎng)基、補(bǔ)料和能源的巨大浪費(fèi)?？司`和安菌素作為新型抑菌劑能使一般雜菌的羧肽酶、轉(zhuǎn)化酶失活，抑制雜菌細(xì)胞壁的擴(kuò)增，能同時(shí)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)分裂，以此來達(dá)到殺菌的目的，已經(jīng)在酒精發(fā)酵和食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，效果比較理想［11］。青霉素中的β-內(nèi)酰胺可以作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，直接阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的目的。在酒精發(fā)酵和藻類自養(yǎng)培養(yǎng)過程中也有較多的應(yīng)用［12－13］。

克菌靈、安菌素、青霉素的毒性都比較小，同屬于干擾細(xì)胞細(xì)胞壁從而達(dá)到抑菌、殺菌目的的抗生素，目前尚未見這3種抑菌劑在藻類發(fā)酵中獲得應(yīng)用的報(bào)道。本研究希望通過考察不同濃度抑菌劑對(duì)小球藻發(fā)酵的影響，以及在染菌條件下對(duì)雜菌的抑制情況，獲得抑菌劑的最佳使用量，以達(dá)到通過使用抑菌劑來減少由于倒料造成經(jīng)濟(jì)損失的目的。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑

酵母粉，安琪酵母有限公司;葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)有限公司;青霉素，石家莊制藥集團(tuán)有限公司;克菌靈，廣西萬佳食品發(fā)展公司;安菌素，柳州龍?zhí)┛萍加邢薰?其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和培養(yǎng)條件

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株

異養(yǎng)小球藻(Heterotrophic Chlorella)，由清華大學(xué)生命科學(xué)院提供。細(xì)菌，由50 L發(fā)酵罐中染桿菌的發(fā)酵液經(jīng)稀釋涂布、挑選單菌落培養(yǎng)而成。

1.2.2 抑菌劑處理方法

在無菌室中，將抑菌劑加入一定體積的無菌水中，分別配成質(zhì)量濃度為5、50、500 mg/mL的溶液備用。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)

抑菌試驗(yàn)所采用的受試菌為50 L發(fā)酵罐中染桿菌的發(fā)酵液經(jīng)稀釋涂布、挑選單菌落培養(yǎng)而成。

抑菌圈試驗(yàn)采用紙片法:制備濃度約為105CFU/mL的桿菌懸液，取20 mL桿菌懸液倒入300 mL溶化并已冷卻至40～45℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，搖勻后迅速分裝于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿15 mL，待凝固后，將20 μL各抑菌劑溶液加入到已消過毒的圓形紙片(Φ 6 mm)上，略干后貼于培養(yǎng)基平板上，同時(shí)作各溶劑的空白對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，24 h)，培養(yǎng)完成后觀察結(jié)果，測(cè)量抑菌圈直徑［14］。

小球藻接種量10%。培養(yǎng)條件:發(fā)酵溫度28℃，pH 6.5，轉(zhuǎn)速為間歇調(diào)節(jié)(干重＜20 g/L，轉(zhuǎn)速為200 r/min;20 g/L＜干重＜50 g/L，轉(zhuǎn)速為300 r/min;50 g/L＜干重＜70 g/L，轉(zhuǎn)速為400 r/min;干重 ＞70 g/L，轉(zhuǎn)速為450 r/min)采用間歇補(bǔ)料，葡萄糖含量低于10 g/L時(shí)補(bǔ)料。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉 3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，F(xiàn)e2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬 酸 鈉0.044。

1.2.4 搖瓶試驗(yàn)

平板上的藻細(xì)胞單菌落接入搖瓶，200 r/min，28℃下培養(yǎng)7 d，種子培養(yǎng)合格時(shí)種子液中應(yīng)無菌、干重達(dá)到10 g/L以上。搖瓶試驗(yàn)采用2 L搖瓶發(fā)酵，裝液量50%。培養(yǎng)條件:溫度28℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。搖瓶培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉 3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，F(xiàn)e2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬酸鈉0.044。

1.2.5 發(fā)酵試驗(yàn)

發(fā)酵試驗(yàn)所采用的受試菌為異養(yǎng)小球藻以及50 L發(fā)酵罐中染桿菌的發(fā)酵液經(jīng)稀釋涂布、挑選單菌落培養(yǎng)而成的液體雜菌。發(fā)酵試驗(yàn)采用50 L正常發(fā)酵的空白試驗(yàn)和50 L接入液體雜菌、添加抑菌劑試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比。其中添加抑菌劑的試驗(yàn)罐在接種時(shí)同時(shí)接入1 mL液體雜菌。

發(fā)酵試驗(yàn)采用50 L發(fā)酵，接種量10%，發(fā)酵溫度28 ℃，pH 6.5，通風(fēng)量 2 m3/(L·h)［1］，轉(zhuǎn)速為間歇調(diào)節(jié)(干重＜20 g/L，轉(zhuǎn)速為200 r/min;20 g/L＜干重＜50 g/L，轉(zhuǎn)速為300 r/min;50 g/L＜干重＜70 g/L，轉(zhuǎn)速為400 r/min;干重 ＞70 g/L，轉(zhuǎn)速為450 r/min)采用間歇補(bǔ)料，葡萄糖含量低于10 g/L時(shí)補(bǔ)料。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L):葡萄糖30、酵母粉3，KH2PO40.075，MgSO40.075、CaCl20.025、K2HPO40.175，蛋白胨 3，(NH4)2SO41，F(xiàn)e2(SO4)33，ZnSO40.072，MnCl20.581，鉬酸鈉0.044。

1.3 分析方法

葡萄糖含量采用HPLC法測(cè)定，細(xì)胞數(shù)采用血球板計(jì)數(shù)。干重測(cè)定方法:取10 mL發(fā)酵液，離心后棄上清液，加蒸餾水至10 mL，再次離心，100℃下烘干藻泥，然后計(jì)算干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果

抑菌圈試驗(yàn)過程比較簡(jiǎn)單、快捷，可以有效地反映出菌體對(duì)藥物試劑的敏感程度，畜牧業(yè)已經(jīng)廣泛的使用抑菌圈來判定抑菌效果。根據(jù)常用藥敏試驗(yàn)敏感度判定標(biāo)準(zhǔn)［15］，一般抑菌圈直徑在15 mm以上為高敏，10～14 mm為中敏，10 mm以下為低敏，0 mm為不敏感。為了克服小球藻染菌問題，研究人員需要不斷的開展試驗(yàn)以篩選菌體相對(duì)比較敏感的藥物試劑。染菌小球藻發(fā)酵液中分離出的桿菌對(duì)安菌素、克菌靈等抑菌劑敏感性結(jié)果見表1。

表1 抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of antibacterial experiment

如表1所示，一定質(zhì)量濃度的抑菌劑均對(duì)該桿菌有抑制作用，并且隨著抑菌劑濃度升高，抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)抑菌劑濃度低于50 mg/mL時(shí)均表現(xiàn)為中、低敏，當(dāng)抑菌劑濃度達(dá)到500 mg/mL時(shí)，安菌素和克菌靈表現(xiàn)為高敏，而青霉素則表現(xiàn)為中敏。安菌素和克菌靈的抑菌圈直徑進(jìn)行單因素方差分析P=0.000 182差異不是太大。而克菌靈和青霉素P=0.013 769，安菌素和青霉素P=0.006 437，之間差異明顯較大。安菌素和克菌靈在添加500 mg/L時(shí)抑菌圈＞15 mm處于在高敏區(qū)，而青霉素在添加500 mg/L時(shí)抑菌圈介于10 mm與10 mm處于在中敏區(qū)但接近高敏的標(biāo)準(zhǔn)，從抑菌圈所表現(xiàn)出來的抑菌效果，依次是克菌靈、安菌素、青霉素為了更好的區(qū)分。微生物發(fā)酵試驗(yàn)中添加任何試劑都需要考慮其對(duì)發(fā)酵過程的影響，為了考察抑菌劑對(duì)小球藻發(fā)酵過程的影響、找到更合適的抑菌劑用量，需進(jìn)一步開展搖瓶試驗(yàn)。

2.2 搖瓶試驗(yàn)結(jié)果

搖瓶試驗(yàn)可以直觀地反映微生物發(fā)酵過程中微生物生長(zhǎng)狀況，在進(jìn)行配方等試驗(yàn)時(shí)，使用搖瓶開展試驗(yàn)，可以快速、低成本地獲取相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果。微生物在搖瓶中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速度、在搖瓶中的生長(zhǎng)速度，能夠直接說明了微生物對(duì)該配方的適應(yīng)性。而抑菌劑小球藻在發(fā)酵過程中的影響也會(huì)在搖瓶試驗(yàn)中直觀的觀察出來。

2.2.1 添加安菌素的搖瓶試驗(yàn)結(jié)果

安菌素是近兩年開發(fā)出來的新型抑菌劑，在酒精發(fā)酵行業(yè)獲得了一定的應(yīng)用，能夠起到良好的抑菌效果，目前尚未應(yīng)用到藻類培養(yǎng)領(lǐng)域。

如圖1所示，添加100 mg/L的安菌素，發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度、葡萄糖含量變化趨勢(shì)和終了干重與空白樣基本吻合，說明添加100 mg/L的安菌素不會(huì)對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)生明顯的影響。而增大添加量以后，小球藻的發(fā)酵過程出現(xiàn)較為明顯的波動(dòng)，且隨著安菌素添加量的增加，小球藻終了干重呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)、葡萄糖消耗減慢。說明增大添加量以后安菌素對(duì)小球藻的發(fā)酵過程產(chǎn)生了負(fù)面的影響，藻細(xì)胞增殖速度減慢。在發(fā)酵第5 d，添加500 mg/L的安菌素的小球藻發(fā)酵液中出現(xiàn)了絮狀物，經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)未染雜菌，可能是添加較多量的安菌素后小球藻發(fā)生了絮凝。

圖1 添加安菌素對(duì)發(fā)酵過程影響Fig.1 Effect of Anjunsu on Chlorella fermentation

2.2.2 添加青霉素的搖瓶試驗(yàn)結(jié)果

青霉素是目前藻類培養(yǎng)過程中使用較多的抑菌劑，王江濤、周文禮等人的研究表明，低于100 mg/L的青霉素在自養(yǎng)小球藻培養(yǎng)過程中可以明顯起到抑菌的作用且不會(huì)對(duì)小球藻、金藻等藻類產(chǎn)生葉綠素a產(chǎn)生抑制。而王衛(wèi)東等人的研究則表明，添加300 IU/mL的青霉素不僅會(huì)抑制雜菌而且還會(huì)對(duì)球等鞭金藻的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用［12－14］。

圖2 添加青霉素對(duì)發(fā)酵過程影響Fig.2 Effect of penicillin on Chlorella fermentation

如圖2所示，添加100 mg/L的青霉素，發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度和葡萄糖含量變化趨勢(shì)在發(fā)酵前期與空白樣基本吻合，而進(jìn)入到第4天，添加青霉素的發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度開始落后于空白樣，而且終了干重也低于空白樣。說明添加100 mg/L的青霉素已經(jīng)對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)生明顯的影響。而隨著添加量增大，小球藻在發(fā)酵過程中葡萄糖消耗速度減慢，發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度變化越來越低，且小球藻終了干重也呈現(xiàn)越來越低的趨勢(shì)。說明增大添加量以后青霉素對(duì)小球藻的發(fā)酵過程產(chǎn)生了較為明顯負(fù)面的影響，藻細(xì)胞增殖速度受到抑制。

2.2.3 添加克菌靈的搖瓶試驗(yàn)結(jié)果

克菌靈是近兩年開發(fā)出來的新型抑菌劑，在酒精發(fā)酵行業(yè)獲得了一定的應(yīng)用。在發(fā)酵初期添加，起到抑制雜菌生長(zhǎng)、減少硫酸用量、減弱發(fā)酵醪酸度的作用［16］。目前尚未應(yīng)用在藻類培養(yǎng)領(lǐng)域。

如圖3所示，添加各個(gè)比例的克菌靈，整個(gè)發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)均和終了干重與空白樣相比均基本吻合，僅終了干重略低，說明安菌素不會(huì)對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)生明顯的影響。添加100 mg/L的克菌靈整個(gè)發(fā)酵過程干重質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)均和終了干重與空白樣相比基本相同。

圖3 添加克菌靈對(duì)發(fā)酵過程影響Fig.3 Effect of Kejunling on Chlorella fermentation

對(duì)比安菌素、青霉素、克菌靈搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，安菌素的添加會(huì)引起小球藻在發(fā)酵過程中葡萄糖消耗和細(xì)胞增殖有所減慢，而青霉素的添加則會(huì)引起小球藻發(fā)酵過程劇烈變化，葡萄糖消耗和藻細(xì)胞干重質(zhì)量濃度均為空白樣的一半。而克菌靈添加則沒有對(duì)小球藻發(fā)酵過程造成明顯影響。結(jié)合平板抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果，添加100 mg/L的克菌靈抑菌效果良好，且添加量較小在發(fā)酵過程中不會(huì)對(duì)小球藻的正常發(fā)酵過程造成明顯的影響，比較適合在小球藻發(fā)酵過程中使用。

2.3 50 L發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

搖瓶試驗(yàn)結(jié)果可以直觀的反映發(fā)酵過程，由于轉(zhuǎn)速、通風(fēng)、溫度、pH等因素影響，搖瓶試驗(yàn)結(jié)果又不能完全反映發(fā)酵過程。搖瓶試驗(yàn)結(jié)果必須在發(fā)酵罐中進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。

如圖4所示，正常發(fā)酵試驗(yàn)(空白)發(fā)酵過程中干重增加較為平穩(wěn)，而接種時(shí)同時(shí)接入雜菌的對(duì)照組(100 mg/L)在發(fā)酵處于延滯期的前2天，生長(zhǎng)與空白組沒有太大差別，而在發(fā)酵進(jìn)入第3、4天兩者之間干重質(zhì)量濃度、每天干重增加量差距比較明顯，發(fā)酵處于停滯狀態(tài)，如果不采取挽救措施，整個(gè)發(fā)酵會(huì)以失敗而告終。而加入100 mg/L克菌靈后，小球藻的生長(zhǎng)逐步恢復(fù)正常。在加入克菌靈24 h后，鏡檢已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不了雜菌。在第5天以后發(fā)酵過程中干重增長(zhǎng)趨勢(shì)與對(duì)照基本一致，而發(fā)酵終了干重的質(zhì)量濃度也僅比空白組低10 g/L。結(jié)果表明在染菌以后添加克菌靈可以有效地抑制雜菌，并成功挽救發(fā)酵。

圖4 50 L發(fā)酵罐中克菌靈對(duì)小球藻發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of Kejunling on Chlorella fermentation in a 50 L fermenter

2.4 添加抑菌劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

從表1中可以看出，在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，由于染菌的影響，小球藻終了干重、藻油含量、平均每天干重增加量均比正常發(fā)酵過程偏低，但是由于添加了抑菌劑及時(shí)抑制了細(xì)菌對(duì)小球藻正常生長(zhǎng)的影響，所以發(fā)酵沒有因染菌而失敗，而是在停滯一段時(shí)間后恢復(fù)了正常生長(zhǎng)，因此使用抑菌劑挽救了染菌的發(fā)酵過程。

表1 添加抑菌劑對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響Table 1 The effect of fermentation results by adding bacteriostatic agent

3 結(jié)論

(1)雜菌(桿菌)生長(zhǎng)較快，能夠在發(fā)酵過程中迅速占據(jù)種群優(yōu)勢(shì)，消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致小球藻不能夠正常生長(zhǎng)，每天干重增加量迅速下降，如果不采取挽救措施，會(huì)直接導(dǎo)致發(fā)酵失敗。

(2)在加入克菌靈后，在24 h后鏡檢已經(jīng)不能發(fā)現(xiàn)雜菌(桿菌)，克菌靈能夠有效的抑制雜菌(桿菌)。

(3)空白組的終了干重為88.4 g/L，日干重增加量為7.36 g/(L·d)，對(duì)照組終了干重為75.2 g/L，每天干重增加量為6.27 g/(L·d)，相比僅降低14.9%。而在沒有添加克菌靈前小球藻的干重一直低于5 g/L，添加克菌靈在抑制了雜菌(桿菌)且成功的挽救了發(fā)酵過程。

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