周愛梅，張靜，鄧愛鵬，高力虎，仲昭財，楊樹林

(南京理工大學(xué)生物工程研究所，江蘇南京，210094)

膠原蛋白是脊椎動物的主要結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛分布于動物結(jié)締組織、韌帶、跟腱等，約占生物體自身總蛋白含量的30%［1－3］。同時，參與細胞的增殖、分化與遷移，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定機械強度［4－6］。因具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可生物降解性以及可大規(guī)模生產(chǎn)的可行性等優(yōu)點［7－8］，膠原蛋白廣泛應(yīng)用于健康食品、化妝品、生物材料和醫(yī)藥工業(yè)［9－11］。目前，膠原蛋白主要來自于動物組織，如牛骨、牛皮或豬皮［12］，但其品質(zhì)，純度和功能都具有不可預(yù)測性［13］。而且，動物源膠原蛋白可能帶有傳染性病原體(如瘋牛病病毒、禽流感病毒)和引發(fā)機體免疫反應(yīng)［14］。重組人源膠原蛋白技術(shù)的發(fā)展，使得高可靠性、高純度、化學(xué)結(jié)構(gòu)確定和低免疫源性膠原蛋白的獲得成為可能。

研究發(fā)現(xiàn)，通過不同的編碼基因進行編碼，至少存在27 種不同的膠原蛋白分子［15－16］，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ型是纖維狀的膠原蛋白［17］。通常，膠原蛋白帶有3條多肽鏈(α鏈)，每條α多肽鏈由甘氨酸充當(dāng)氨基殘基形成甘氨酸-X-Y(Gly-X-Y)重復(fù)結(jié)構(gòu)［18－19］，X和Y可以代表除了甘氨酸以外的其他氨基酸殘基。Ⅲ型膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)是一種同型三聚體［α1(Ⅲ)］3，能強化微血管強度與彈性，可提供細胞充足的養(yǎng)分，并且可以直接與血管母細胞結(jié)合，從而促進新血管形成［20］。因此，Ⅲ型膠原蛋白是一種極好的生物醫(yī)學(xué)組織工程材料。

基于人源Ⅲ型膠原蛋白α1鏈膠原域Gly-X-Y的三肽重復(fù)序列特征，本實驗室成功構(gòu)建了巴氏畢赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6，進行高密度發(fā)酵，獲得Ⅲ型重組人源膠原蛋白。本研究探索利用透析法、鹽析-柱層析結(jié)合法對發(fā)酵上清液內(nèi)RHSC進行純化，同時對純化獲得的膠原蛋白進行結(jié)構(gòu)表征。

1 材料與方法

1.1 材料

巴氏畢赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6，本實驗室構(gòu)建;透析袋14 kDa，南京寶靈科生物;Ⅲ型膠原蛋白，Sigma;Sephadex G100，Amersham Biosciences;其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(FDU-1200，日本Tokyo RIKAKIKAI公司);電泳儀(PROTEANⅡ，美國BIO-RAD);差示掃描量熱儀(TA2100，美國TA公司);紫外可見分光光度計(Ultrospec 4300 pro，美國GE Healthcare);紅外光譜儀(Nicolet iS10，Nicolet);核磁共振波譜儀(Bruker AVANCE 500，Bruker)。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠原蛋白獲得

通過BMG培養(yǎng)基對巴氏畢赤酵母基因工程菌GS115/pPIC9KG6進行高密度發(fā)酵，甲醇低速流加誘導(dǎo)膠原蛋白表達。4℃，12 000 r/min離心5 min，實現(xiàn)菌體與菌液的分離，上清液－20℃保存。對菌體進行細胞裂解，之后細胞裂解液與發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE電泳分析。

1.3.2 透析法純化膠原蛋白

取10 mL的發(fā)酵上清液裝入14 kDa的透析袋內(nèi)，以去離子水作為交換液，置于4℃冰箱，每8 h更換去離子水，分別透析12，24，36和48 h，透析液冷凍干燥。

1.3.3 鹽析-柱層析結(jié)合法純化膠原蛋白

精確稱取0℃時達到 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%飽和度的(NH4)2SO4沉淀所需(NH4)2SO4固體的量。冰水浴條件下，邊緩慢攪拌邊將硫酸銨固體慢慢加入到發(fā)酵上清液中，15 min內(nèi)加完，繼續(xù)攪拌15 min。4℃，10 000 r/min離心5 min，傾出上清液，將沉淀按原體積溶解備用。取40%飽和度硫酸銨沉淀的鹽析溶解液經(jīng)過凝膠柱Sephadex G100，去離子水洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥。

1.3.4 分析方法

1.3.4.1 蛋白回收率測定

蛋白回收率測定采用二喹啉甲酸(BCA)檢測法，以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白，562 nm處測得吸光度值做標準曲線。

按公式計算蛋白回收率(η):

式中:A1，待純化溶液的吸光度值;A2，純化后溶液的吸光度值;V1，待純化溶液的體積，L;V2，純化后溶液的體積，L。

1.3.4.2 RHSC純度分析

運用SDS-PAGE垂直電泳分析RHSC純度，10%的分離膠和5%的濃縮膠，Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)，80 V電壓濃縮蛋白，120 V電壓分離?？捡R斯亮藍R-250染色，Quantity One 4.5.2 軟件分析［21］。

1.4 結(jié)構(gòu)表征

1.4.1 差示掃描量熱法(DSC)分析

稱取2～3 mg RHSC凍干樣品與標準Ⅲ型膠原蛋白，分別密封于DSC坩鍋中，以空坩堝作為參比，從30℃加熱到80℃，升溫速率為10℃/min［22］，氮氣在樣品室中流量為20 mL/min。

1.4.2 紫外掃描分析

取RHSC凍干樣與Ⅲ型膠原蛋白分別配制成1 g/L的膠原蛋白溶液，在200～400 nm的近紫外區(qū)進行光譜掃描。

1.4.3 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析

膠原蛋白基團的特征吸收峰可以被紅外光譜分析檢測，試驗取微量RHSC和Ⅲ型膠原蛋白分別與KBr研磨成粉后壓片。室溫下，在4 000－400 cm－1范圍內(nèi)掃描［23］。

1.4.41 H-NMR和13C-NMR

將RHSC凍干樣溶于D2O中，形成濃度為0.1 mg/mL的NMR樣品。NMR檢測條件:恒溫在298 K，氫譜和碳譜的觀測頻率分別為 500 MHz，125 MHz;采樣次數(shù)分別為64次和8 000次。

2 實驗結(jié)果

2.1 發(fā)酵液與菌體內(nèi)的RHSC分析

如圖1所示，在工程菌細胞裂解液中檢測到了目的蛋白，但含量極少，并且其他雜蛋白含量很高，而發(fā)酵上清液中有大量目的蛋白存在。說明重組人源膠原蛋白是一種細胞外分泌型的膠原蛋白。經(jīng)分析，在發(fā)酵液中RHSC主要以分子質(zhì)量約為112 kDa的二聚體形式存在，同時還有部分分子質(zhì)量為56 kDa的單體。

圖1 重組酵母GS115表達重組人源膠原蛋白的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE profile of RHSC expressed by recombinant yeast GS115

2.2 RHSC的純化

2.2.1 透析純化結(jié)果

透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過達到分離效果的方法［24］。發(fā)酵上清液中色素與小分子雜蛋白都屬于小分子物質(zhì)，可以透過半透膜以除去。試驗發(fā)現(xiàn)，透析超過12 h后，透析袋內(nèi)的液體顏色澄清，表明發(fā)酵上清液內(nèi)的色素已除去。由表1蛋白的回收率與純度關(guān)系可知，RHSC的純度隨著透析時間的增加而有所增高，說明小分子質(zhì)量的雜蛋含量逐漸減少，而目大的蛋白均被截留。但透析時間超過24 h后，RHSC的純度增加并不明顯，而且透析時間過長會對蛋白的活性造成影響。圖2為發(fā)酵上清液透析24 h后的SDS-PAGE譜圖。從圖2中可以看出，RHSC的單體與二聚體條帶清晰，而分子質(zhì)量低于56 kDa的小分子雜蛋白幾乎沒有條帶，說明雜蛋白含量極低。由此可以判斷，發(fā)酵上清液最佳的透析時間為24 h。

表1 RHSC的回收率與純度Table 1 The recovery and purity of RHSC

圖2 發(fā)酵液透析24h后的SDS－PAGE譜圖Fig.2 SDS － PAGE profile of fermentation broth after dialysised 24 h

2.2.2 鹽析-柱層析結(jié)合純化結(jié)果

表2為發(fā)酵上清液經(jīng)過不同飽和度硫酸銨沉淀后二聚體的純度表。

由表2可知，硫酸銨飽和度為20%時不能將RHSC沉淀下來，而飽和度達到30%以后，二聚體能被沉淀出來，并且實現(xiàn)了二聚體與單體的分離。同時，上清液經(jīng)40%飽和度的(NH4)2SO4沉淀，二聚體的純度最高，之后，隨著(NH4)2SO4濃度增高，二聚體純度降低。因此，根據(jù)以上結(jié)果可以確定(NH4)2SO4沉淀的最佳飽和度為40%。圖3為發(fā)酵上清液直接過Sephadex G100與40%飽和度(NH4)2SO4沉淀后經(jīng)過Sephadex G100的SDS-PAGE電泳圖譜，比較可以看出經(jīng)過(NH4)2SO4沉淀后再過Sephadex G100層析柱，不僅實現(xiàn)了二聚體與單體的分離，而且得到的二聚體達到了電泳純。

圖3 RHSC經(jīng)Sephadex G100純化后的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 The SDS-PAGE spectrum of RHSC purified by Sephadex G100 columm chromatography

2.3 RHSC結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 DSC分析

DSC是測定蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性常用的方法，其原理是通過測定物質(zhì)在升溫過程中的吸熱，放熱來反映此種物質(zhì)的相變和化學(xué)反應(yīng)的過程［25］。圖4－(a)、圖4－(b)分別為Ⅲ型膠原蛋白和RHSC的DSC圖譜，可以看出RHSC的Tm40.68℃，與Ⅲ型膠原蛋白的Tm39.36℃基本相同，且測定的Tm值都在文獻報導(dǎo)的膠原蛋白的變性溫度范圍內(nèi)［26］，表明RHSC與Ⅲ型膠原蛋白具有類似結(jié)構(gòu)。

表2 不同飽和度硫酸銨沉淀后RHSC的純度表Table 2 Purities of RHSC precipitated by ammonium sulfate

圖4 膠原蛋白DSC圖譜Fig.4 The DSC spectrums of collagen

2.3.2 紫外光譜分析

圖5 膠原蛋白紫外掃描圖Fig.5 UV scan of collagen

2.3.3 紅外掃描分析

由圖6可知，標準的Ⅲ型膠原蛋白的紅外譜圖中的主要峰在RHSC的紅外譜圖中都有所體現(xiàn)，說明兩者微觀結(jié)構(gòu)存在著很大的相似性。在圖6－(b)圖中，3 307 cm－1附近吸收峰是酰胺A帶N—H伸縮振動，并且N—H參與形成氫鍵［27］。3 080 cm－1附近是酰胺B帶的C—H伸縮振動;1 661 cm－1處是酰胺Ⅰ帶的CO伸縮強峰，并且伴隨著氫鍵的作用;1 541 cm－1處吸收峰是酰胺Ⅱ帶的N—H彎曲振動和酰胺基C—N伸縮振動;1 242 cm－1為酰胺Ⅲ帶的N—H伸縮振動變形峰。

圖6 膠原蛋白的紅外譜圖Fig.6 IR spectra of collagen

2.3.4 RHSC的1H-NMR和13C-NMR譜分析

對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究，核磁共振譜將會顯得越來越重要，它將提供更多的信息。目前，核磁共振譜在膠原蛋白上的應(yīng)用還很少［28］。RHSC基因序列的設(shè)計是基于人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈膠原域三肽重復(fù)序列特征，其編碼的氨基酸主要包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)和絲氨酸(Ser)等。本研究根據(jù)何有節(jié)等［29－30］提供的明膠標準氫譜和碳譜的譜線歸屬表，對RHSC的譜線進行歸屬。從表3、表4的結(jié)果可知，RHSC的氫譜與碳譜的主要峰和其含有的主要氨基酸產(chǎn)生的峰可以一一對應(yīng)。因此，核磁共振波譜的結(jié)果從分子結(jié)構(gòu)上佐證了發(fā)酵產(chǎn)生的RHSC即為目的蛋白。

圖7 RHSC的1H-NMRFig.7 1H-NMR of RHSC

表3 RHSC的1H-NMR譜峰歸屬Table 3 Attribute the1H-NMR to RHSC

表4 RHSC的13C-NMR譜峰歸屬Table 4 Attribute13C-NMR to RHSC

圖8 RHSC的13C-NMR譜圖Fig.8 13C-NMR of RHSC

3 結(jié)論與討論

采用高密度發(fā)酵獲得的RHSC量近于總蛋白量的60%，約為15 g/L，表達量豐富，利于擴大再生產(chǎn)。在整個發(fā)酵行業(yè)，分離純化是限制發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的因素，純化費用約占整個產(chǎn)值的20%～30%，甚至更高，因而從發(fā)酵液中分離純化出目蛋白顯得尤為重要。本試驗采用低溫高速離心的方法分離菌體與菌液，并且運用2種純化方法對發(fā)酵上清液進行純化，獲得不同的產(chǎn)物。通過透析法獲得的RHSC混合物可用于食品和醫(yī)藥，其降解成小肽后也可應(yīng)用于化妝品行業(yè)。而結(jié)合運用鹽析-柱層析法純化獲得的高純度二聚體可以作為生物醫(yī)學(xué)組織工程材料的原料。同時對純化的膠原蛋白進行了DSC、紫外和紅外光譜分析，并與標準的Ⅲ型膠原蛋白進行比對，結(jié)果表明RHSC具有Ⅲ型膠原蛋白的特征結(jié)構(gòu)。同時，NMR的結(jié)果從結(jié)構(gòu)上也佐證了高密度發(fā)酵獲得的膠原蛋白即為目的蛋白。

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