金科華，劉 潔(湖北科技學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學教研室，咸寧 43700;湖北科技學院護理學院;通訊作者，E-mail:3643986@qq.com)

雙酶切聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳是鑒定DNA重組成功與否的重要方法［1］，瓊脂糖凝膠電泳圖像質(zhì)量直接影響鑒定結(jié)果的判讀、論文發(fā)表。條帶彌散是圖像質(zhì)量不佳的主要表現(xiàn)之一，研究者多將其歸咎于不合理的酶切和不規(guī)范的電泳操作［2］，而很少報道質(zhì)粒抽提策略對彌散的影響。筆者在雙酶切鑒定葡萄糖6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)重組質(zhì)粒pET-28a-G6PD時，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒抽提策略對雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散有顯著影響，現(xiàn)報道如下，以供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

含空質(zhì)粒 pET-28a的大腸桿菌 Top10(pET-28a/Top10)由本教研室保存。重組質(zhì)粒pET-28a-G6PD為筆者構(gòu)建并轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞中。

1.2 試劑與儀器

質(zhì)粒小量提取試劑盒、卡那霉素、50×TAE電泳緩沖液購自上海生工生物工程有限公司，快速限制性核酸內(nèi)切酶為Fermentas公司產(chǎn)品，瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品。酵母浸出粉、胰蛋白胨為OXIOD公司產(chǎn)品。MilliQ超純水為實驗室自制。DNA marker為TAKARA公司產(chǎn)品。POWER Pac HC高電流電源為BIO-RAD公司產(chǎn)品、GIS凝膠成像儀為上海天能公司產(chǎn)品，DYCP-31DN型電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.3 菌液培養(yǎng)

將含 pET-28a和 pET-28a-G6PD的大腸桿菌Top10分別劃線于含100 μg/ml卡那霉素的LB平板中，37℃倒置培養(yǎng)15 h。挑單菌落各1個，接種至40 ml(裝于250 ml三角瓶中)含50 μg/ml卡那霉素的LB中，于搖床內(nèi)37℃ 250 r/min培養(yǎng)，用上述不含菌液的LB作為空白對照，用可見分光光度計測定600 nm處的菌液的光密度值(OD600)，至OD600為 1.6，停止培養(yǎng)。

1.4 取1.4 ml菌液抽提質(zhì)粒

利用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。步驟如下:①分別從各瓶吸取菌液1.4 ml至1.5 ml管心管，室溫10 000 r/min，離心30 s，棄上清;②加250 μl溶液 P1，3 000 r/min 渦旋 1 min;③加 250 μl溶液P2，溫和顛倒混勻10次，室溫靜置4 min;④加入350 μl溶液P3，溫和顛倒混勻10次;⑤室溫12 000 r/min 離心6 min;⑥取750 μl上清于另一1.5 ml離心管，室溫14 000 r/min 離心10 min;⑦取600 μl上清于吸附柱中，室溫9 000 r/min離心30 s;⑧棄濾液，向吸附柱中加500 μl WD1，室溫10 000 r/min離心1 min;⑨棄濾液，向吸附柱中加500 μl wash buffer，室溫 10 000 r/min 離心 1 min;⑩重復(fù)⑨一次;○11棄濾液，將吸附柱置于收集管中，室溫13 000 r/min離心2 min;○12將去蓋的吸附柱置于滅菌的1.5 ml離心管，做好標記，向吸附柱中加入80 μl滅菌超純水，室溫靜置2 min，13 000 r/min離心1 min，收集濾液，冰浴備用。

1.5 取2×0.7 ml菌液抽提質(zhì)粒

分別從各瓶取菌液0.7 ml至1.5 ml離心管，平行抽提兩份，按1.4①-⑥抽提質(zhì)粒，將⑥后的兩份平行抽提的上清各600 μl收集于1.5 ml離心管，于同一吸附柱內(nèi)分兩次進行⑦，后續(xù)步驟與1.4相同。

1.6 取4×0.35 ml菌液抽提質(zhì)粒

分別從各瓶取菌液0.35 ml至1.5 ml離心管，平行抽提四份，按1.4中①-⑥抽提質(zhì)粒，將⑥后的四份平行抽提的上清各600 μl收集于5 ml離心管，于同一吸附柱內(nèi)分4次進行⑦，后續(xù)步驟與1.4相同。

1.7 質(zhì)粒的雙酶切反應(yīng)

1.4 ml，2 × 0.7 ml，4 × 0.35 ml菌液抽提的pET-28a經(jīng) NanoDrop 2000測定濃度分別為116，125，130 ng/μl;pET-28a-G6PD 的濃度分別為 120，134，145 ng/μl。用滅菌超純水將所有質(zhì)粒稀釋至116 ng/μl。酶切體系:空質(zhì)粒(或重組質(zhì)粒)1 μg，Nde Ⅰ、Xho Ⅰ各 1 μl，10 × FD Green Buffer 2 μl，加水至 20 μl?；靹?，37 ℃酶切 1 h。

1.8 雙酶切質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

配制1.2%的瓊脂糖凝膠。將2 μl 1 kb DNA ladder marker(與13 μl 1 ×TAE 及 3 μl 6 ×Loading Buffer混勻)、雙酶切的 pET-28a、雙酶切 pET-28a-G6PD全量加入上樣孔，130 V電泳30 min。

1.9 質(zhì)粒純度的測定

利用NanoDrop 2000測定三種策略抽提的質(zhì)粒pET-28a和 pET-28a-G6PD 的OD260、OD280值，評估質(zhì)粒純度。

1.3-1.9的實驗進行4次重復(fù)(獨立實驗)。

2 結(jié)果

2.1 雙酶切后的質(zhì)粒電泳圖譜

按策略1.4，1.5，1.6 抽提的質(zhì)粒酶切后電泳圖譜見圖1?？芍?，按1.4策略抽提的質(zhì)粒pET-28a和pET-28a-G6PD雙酶切后均嚴重彌散，盡管第2泳道中酶切產(chǎn)生的大片段(略大于5 000 bp)、小片段(介于1 000-2 000 bp)分別與pET-28a(5 239 bp)、G6PD分子量(1 548 bp)相符，但其相對亮度與理論不符;按1.5策略抽提的pET-28a酶切后在＜1 000 bp范圍內(nèi)彌散明顯減少，pET-28a-G6PD酶切后的彌散有明顯改善，大片段的亮度明顯高于小片斷;按1.6策略抽提的pET-28a和pET-28a-G6PD酶切后的彌散幾乎完全消失，pET-28a-G6PD酶切產(chǎn)生的大、小片段亮度比值接近理論值。

2.2 質(zhì)粒純度測定

圖1 不同抽提策略的質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳圖譜Figure 1 Agarose gel electrophoresis of plasmids after double digestion by different strategies of plasmid extraction

策略1.4，1.5，1.6 抽提的質(zhì)粒 pET-28a 和 pET-28a-G6PD的4次實驗的OD260/OD280平均值分別為1.36 和 1.45，1.65 和 1.70，1.75 和 1.78。可見，菌液越少，質(zhì)粒的純度越高，所含蛋白雜質(zhì)越少。

3 討論

質(zhì)粒的雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳的原理簡單，易于掌握;但要獲得理想的瓊脂糖凝膠電泳圖片，需要在多個環(huán)節(jié)上下功夫。導致電泳圖片效果不佳的原因很多，有些無法從文獻找到答案，需根據(jù)具體情況分析，并用實驗檢驗。酶切后彌散是瓊脂糖凝膠電泳常見的實驗現(xiàn)象之一，導致彌散的原因有:①質(zhì)粒DNA中含有DNase，在酶切緩沖液的Mg2+作用下激活，水解質(zhì)粒［3］。②不正確的酶切，如酶用量過多、酶切時間過長、酶切緩沖液錯誤，導致質(zhì)粒被切碎。③不合理的電泳緩沖液，如緩沖液陳舊、緩沖液配制錯誤(如pH和鹽離子濃度錯誤)。④瓊脂糖凝膠配制錯誤。

本研究所用菌株Top10為end A(編碼非特異性DNA內(nèi)切酶Ⅰ)突變型，同時溶解質(zhì)粒的超純水均為滅菌后一次使用，可排除DNA酶對質(zhì)粒的降解。隨著優(yōu)質(zhì)的限制性內(nèi)切酶及其通用緩沖液的出現(xiàn)，酶切操作極為簡便，不正確酶切發(fā)生的概率很小。即用型商品化電泳緩沖液的推出，極大減少了因緩沖液和瓊脂糖配制錯誤所致的彌散。為此，筆者推測電泳彌散與上述四個原因無關(guān)，可能是質(zhì)粒純度低所致。

雖然試劑盒法提取質(zhì)粒速度快、純度高［4］，但仍有不少細節(jié)需要在操作時注意。如說明書要求取過夜培養(yǎng)的菌液1.5-5 ml用于質(zhì)粒的抽提，其中過夜培養(yǎng)是一個模糊時間，8-16 h均可認為是過夜培養(yǎng)，不同過夜培養(yǎng)時間導致的菌液濃度相差懸殊。此外接種時菌落的生長狀態(tài)和大小，以及菌株的生長速度均會導致相同培養(yǎng)時間菌液濃度不一。故需要摸索菌液用量，調(diào)整抽提策略，而不能“盡信書”。在按照 1.4，1.5，1.6 的策略抽提時，發(fā)現(xiàn)向1.4 ml菌液所含菌體中加入溶液P2裂解后，需要在顛倒混勻后靜置4 min，菌體才變?yōu)橥该鞯娜芤?用0.7 ml或0.35 ml菌液抽提質(zhì)粒時，加入溶液P2顛倒混勻后，立即變?yōu)槌吻迦芤?，無需靜置，且三種策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取1.4 ml菌液抽提質(zhì)粒，不進行菌液用量的比較，很容易認為1.4的透明溶液就是澄清溶液，就繼續(xù)后續(xù)的操作步驟。

如不測定質(zhì)粒純度，貿(mào)然進行酶切操作，極易導致酶切鑒定圖片質(zhì)量不佳，甚至導致無法觀察到酶切產(chǎn)生的目的條帶，嚴重影響結(jié)果的判斷。同時，不純的重組質(zhì)粒嚴重影響測序［5］。純度測定表明，等量的菌液分成小份多次抽提所得到的質(zhì)粒純度逐步提高，酶切后電泳彌散現(xiàn)象逐步消失。其原因可能是分次抽提時，菌體充分裂解，蛋白和基因組DNA充分變性，在加入溶液P3后變性的蛋白和基因組DNA沉淀更完全，故蛋白質(zhì)和基因組DNA污染減少;同時因裂解單位質(zhì)量的菌體所用的溶液P1(含有RNA酶)增多，RNA也清除得更徹底。

總之，通過本文的研究，筆者發(fā)現(xiàn)采用雙酶切聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒時，質(zhì)粒的抽提策略對酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散有顯著影響。用過多的菌液抽提質(zhì)粒，因裂解不充分，導致菌體蛋白等雜質(zhì)難以去除，所提質(zhì)粒純度低，易導致雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳彌散。

［1］蔣俊豪，賀修勝.PCR-雙酶切鑒定STGC3抑癌基因重組子假陽性研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2007，7(6):819-823.

［2］曹秀華，王亞婷，李麗，等.瓊脂糖凝膠電泳的條件優(yōu)化—質(zhì)粒DNA重組片段的限制性內(nèi)切酶譜鑒定［J］.齊齊哈爾醫(yī)學院學報，2011，32(01):9-11.

［3］薩姆布魯克J，拉賽爾DW.分子克隆實驗指南［M］.3版.黃培堂，譯.北京:科學出版社，2002:35.

［4］馬滋蔓，王文治，楊本鵬，等.農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的間接酶切鑒定［J］.生物技術(shù)通報，2009，(7):171-173.

［5］毛偉華，高其康.水稻大規(guī)模質(zhì)粒測序影響因素分析［J］.中國水稻科學，2004，18(5):420-424.