遲濤，田木，張欣宇，鐘姝凝，張鐵華，王玉堂，劉鵬

(1.國家乳業(yè)工程技術(shù)中心黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱150028；2.吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程系,長春130062；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱150030)

0 引言

隨著抗生素的長期使用，其表現(xiàn)出的弊端日益明顯，如引起耐藥性、藥物殘留等缺點[1]。微生態(tài)制劑又可稱為促生素、益生素、活菌制劑等[2]，以微生態(tài)學(xué)理論為指導(dǎo)，采用單一菌種培養(yǎng)或多菌種復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)過發(fā)酵技術(shù)制備而成[3,4]。現(xiàn)在市場上常見的微生態(tài)制劑為單菌制劑，對復(fù)合微生態(tài)制劑的研究還比較少。微生態(tài)制劑常用的保護(hù)劑有很多種，按保護(hù)劑的分子量大小可以分為高分子保護(hù)劑和低分子保護(hù)劑[5-6]。本實驗選取乳酸菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌為實驗菌株，其中乳酸菌、酵母菌來源于已證明對人類具有很好生理功能的“開菲爾?！睆?fù)合菌相，通過多菌株復(fù)合培養(yǎng)制備一種高活力的益生菌復(fù)合微生態(tài)制劑。

1 實驗

1.1 材料與儀器

開菲爾粒，枯草芽孢桿菌。全自動真空冷凍干燥機，超低溫冰箱，離心機，生化培養(yǎng)箱，生物安全柜。

1.2 方法

1.2.1 開菲爾粒中乳酸菌、酵母菌的分離純化及活化

1.2.1.1 乳酸菌、酵母菌的分離純化

在小試管中裝少量滅菌生理鹽水，取一小塊開菲爾粒放入小試管中并用玻璃棒搗碎，取少量試管內(nèi)樣品分別涂到MRS固體瓊脂培養(yǎng)基和麥芽汁-瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基分別置于37℃和培養(yǎng)箱中分別恒溫培養(yǎng)48～72 h和12～72 h。挑取經(jīng)顯微鏡檢測符合乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)的菌落劃線接種到MRS固體瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)做幾次得到純化乳酸菌菌株；符合酵母菌標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)的菌落劃線接種到麥芽汁-瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～72 h，重復(fù)做幾次得到純化酵母菌菌株，得到的乳酸菌菌株和酵母菌菌株再分別接種到人工模擬胃液及腸液環(huán)境進(jìn)行篩選，篩出耐酸及膽鹽的優(yōu)勢菌株[7]，并分別接種于MRS半固體培養(yǎng)基和麥芽汁液體培養(yǎng)基中，分別放到37℃和28℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18～24 h。放4℃冰箱中保存，供實驗用[8]。

1.2.1.2 乳酸菌、酵母菌活化

按脫脂乳粉∶蒸餾水=1∶10的培養(yǎng)基中接種對酸及膽鹽耐受性好的乳酸菌、酵母菌，在23℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h。放4℃冰箱中保存，供實驗用。

1.2.1.3 枯草芽孢桿菌活化

配置活化培養(yǎng)基（均為質(zhì)量濃度）：葡萄糖12.11 g/L，牛肉膏23.31 g/L，磷酸二氫鉀2.33 g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.5，滅菌后接種經(jīng)鏡檢符合枯草芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)的，生長狀態(tài)良好的枯草芽孢桿菌，在37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中搖床震蕩培養(yǎng)18 h。放4℃冰箱中保存，供實驗用。

1.2.2 菌種復(fù)配

菌種復(fù)合培養(yǎng)的培養(yǎng)基（均為質(zhì)量濃度，g/L）：濃縮乳清蛋白粉 20，酵母粉7.64，乳清粉26.6，脫脂乳40，葡萄糖 13.4，碳酸鈣 6.2，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.03；調(diào)節(jié)pH值為7.0，將活化后的乳酸菌、酵母菌與枯草芽孢桿菌按1∶1∶1比例接種到此培養(yǎng)基中，在32℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.3 凍干保護(hù)劑單因素篩選

冷凍干燥過程會對微生物產(chǎn)生影響，容易降低微生態(tài)制劑中的活菌總數(shù)。因此在進(jìn)行冷凍干燥前添加保護(hù)劑，不但可以恢復(fù)微生態(tài)原有的生物活性，還可以提高微生態(tài)制劑的活菌數(shù)。本研究選取的保護(hù)劑為脫脂乳、海藻糖、谷氨酸鈉、吐溫-80和甘油等，如表1所示。

表1 微生態(tài)制劑保護(hù)劑單因素水平 %

1.2.4 制備方法

（1）冷凍干燥及凍干存活率。

將活化好的菌種乳酸菌、酵母菌與枯草芽孢桿菌按1∶1∶1比例加到高密度培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)18 h，對發(fā)酵液進(jìn)行離心（6 000 r/min,15 min,4℃[9]），棄上清液，收集離心后的菌體，將離心后收集到的菌體加入到保護(hù)劑中，其中保護(hù)劑與菌體的體積比為3∶1[10]，混合均勻備用。在進(jìn)行冷凍干燥之前，樣品需在-80℃超低溫冰箱預(yù)凍至少5 h，使樣品中的水以固體冰的形式存在，取出樣品放入冷凍干燥機進(jìn)行真空冷凍干燥；用凍干存活率的大小表示保護(hù)劑對菌體保護(hù)效果的好壞。凍干存活率計算公式為[11]

凍干存活率=（凍干后每克制劑中活菌總數(shù)×制劑質(zhì)量）/（凍干前每毫升菌液活菌總數(shù)×菌液總體積）×100%。

（2）乳酸菌活菌總數(shù)測定。采用MRS固體培養(yǎng)基，把培養(yǎng)皿置于36℃±1℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48h±2 h，活菌計數(shù)。參見GB/T 4789.35-2010。

（3）酵母菌活菌總數(shù)測定。采用孟加拉紅培養(yǎng)基，把培養(yǎng)皿置于28℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，活菌計數(shù)。參見GB/T 4789.15-2010。

（4）枯草芽孢桿菌測定。按國標(biāo)配置好枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基，滅菌后使用。把培養(yǎng)皿置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2 h，活菌計數(shù)。參見GB/T 26428-2010。

1.2.5 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

將單因素篩選出的保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑脫脂乳粉、海藻糖和甘油做響應(yīng)面實驗，以脫脂乳粉、海藻糖和甘油為實驗因素，用Box-behnken設(shè)計法設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面實驗，用存活率作為檢測指標(biāo)，實驗因素與水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗因素與水平

1.2.6 活菌變化實驗

冷凍干燥得到的益生菌復(fù)合微生態(tài)制劑置于4℃冰箱中儲存。每隔一個月按照乳酸菌國標(biāo)計數(shù)方法對乳酸菌進(jìn)行平板計數(shù)，做平行實驗三次；按照酵母菌國標(biāo)計數(shù)方法對酵母菌進(jìn)行平板計數(shù)，做平行實驗三次；按照枯草芽孢桿菌國標(biāo)計數(shù)方法對枯草芽孢桿菌進(jìn)行平板計數(shù)，做平行實驗三次。計算益生菌復(fù)合微生態(tài)制劑所含乳酸菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌的活菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各種凍干保護(hù)劑單因素實驗結(jié)果

表3為微生態(tài)制劑凍干保護(hù)劑單因素實驗結(jié)果。由表3可以看出，加入保護(hù)劑后，存活率都有所提高，只是提高程度的大小不同。在幾種保護(hù)劑中可以看出脫脂乳、海藻糖、吐溫-80及甘油的保護(hù)效果要好于谷氨酸鈉。其中脫脂乳為高分子保護(hù)劑，且保護(hù)效果最好，存活率最低為61%，最高為70.3%。保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)從6%增加到14%時存活率也增大，在保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)14%時達(dá)到最大值，繼續(xù)增大保護(hù)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)會抑制菌體的生長。海藻糖、吐溫-80及甘油的都屬于低分子保護(hù)劑，這三種保護(hù)劑的保護(hù)效果差異不大，且甘油對枯草芽孢桿菌的保護(hù)效果最優(yōu)，海藻糖在高溫、高寒條件下起到顯著的保護(hù)作用，海藻糖和甘油的最高凍干存活率分別為57.7%和64.4%。谷氨酸鈉的保護(hù)效果明顯低于其余幾種保護(hù)劑的保護(hù)效果，最高凍干存活率僅為40.6%。

本研究制備的復(fù)合微生態(tài)制劑包括乳酸菌、酵母菌以及枯草芽孢桿菌三種菌株。綜合起來考慮，脫脂乳、海藻糖和甘油三種物質(zhì)對乳酸菌、酵母菌及枯草芽孢桿菌都有較好的保護(hù)作用，因此選擇這三種物質(zhì)組成復(fù)配保護(hù)劑，深入研究復(fù)配保護(hù)劑的比例。

表3 微生態(tài)制劑凍干保護(hù)劑單因素實驗結(jié)果

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

在前面單因素分析結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行科學(xué)系統(tǒng)的探討，單因素對實驗的最終結(jié)果影響并不全面，每個單因素間還存在著協(xié)同或抑制的關(guān)系，因此選擇響應(yīng)面分析法對影響微生態(tài)制劑中活菌存活率的凍干保護(hù)劑進(jìn)行探討。

表4 Box-Behnken 實驗設(shè)計與結(jié)果

借助于Design Expert軟件，對復(fù)合微生態(tài)制劑保護(hù)劑的最優(yōu)復(fù)配比例進(jìn)行科學(xué)分析，結(jié)果如表4所示。由表4可知實驗因子對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為

Y=89.24-0.75A-0.13B+3.05C-1.92AB-1.88AC-0.72BC-7.11A2-0.057B2-6.01C2，

式中：Y為存活率；A，B，C分別為脫脂乳粉、海藻糖、甘油單位體積內(nèi)溶質(zhì)的質(zhì)量濃度。

表5 回歸模型方差分析

表5為回歸模型方差分析。由表5可以看出，模型組P＜0.01，所以模型顯著。在方差分析表中，當(dāng)P＜0.05時表明模型中變異源顯著，方差分析結(jié)果表明，A2、C2、C、AB及AC影響都是顯著的；當(dāng)P＞0.05時則表示不顯著，從方差分析表可以看出模型失擬項為0.088，此值大于0.05，所以失擬項不顯著，這說明模型擬合程度很好，可以用于分析使用。

通過軟件初步分析，從模型可以看出脫脂乳和甘油對復(fù)合微生態(tài)制劑中微生物的存活率的結(jié)果影響較大，主要采用響應(yīng)面圖表示影響作用的程度，如圖1～圖3所示。

圖1 脫脂乳粉和海藻糖對凍干存活率的交互影響

由圖1可以看出，脫脂乳粉和海藻糖的交互作用顯著，隨著脫脂乳粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凍干存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凍干存活率增大但增大幅度較平緩，當(dāng)脫脂乳粉的濃度在12.00%～16.00%，海藻糖的濃度在4.00%～6.00%時，存活率在此范圍內(nèi)達(dá)到最大值。

由圖2可以看出，脫脂乳粉和甘油的交互作用顯著，隨著脫脂乳粉和甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凍干存活率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)脫脂乳粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.00%～16.00%，甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.25%～1.75%時，存活率在此范圍內(nèi)達(dá)到最大值。

圖2 脫脂乳粉和甘油對凍干存活率的交互影響

圖3 海藻糖和甘油對凍干存活率的交互影響

由圖3可以看出，海藻糖和甘油的交互作用不顯著，隨著海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大凍干存活率增大較緩慢，隨著甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凍干存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)海藻糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.00%～6.00%，甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.25%～1.75%，存活率在此范圍內(nèi)達(dá)到最大值。

通過響應(yīng)面實驗，確定了復(fù)合微生態(tài)制劑保護(hù)劑的最佳配方為脫脂乳14.17%，海藻糖4.00%和甘油1.65%，在此條件下制得的微生態(tài)制劑益生菌存活率最高，可達(dá)到89.91%，其中乳酸菌數(shù)為5.60×1011g-1，酵母菌數(shù)為3.90×1011g-1，枯草芽孢桿菌數(shù)為4.20×1011g-1。

2.3 微生態(tài)制劑活菌變化實驗結(jié)果

表6為微生態(tài)制劑貯藏過程中活菌總數(shù)變化。由表6可以看出，微生態(tài)制劑的活菌存活率在貯藏期間呈下降趨勢，但6個月后仍有較高的活菌數(shù)。冷凍干燥技術(shù)制備的微生態(tài)制劑在6個月后活菌總數(shù)為6.0×109g-1。本研究制備的復(fù)合微生態(tài)制劑耐儲存，在儲存期內(nèi)可以發(fā)揮免疫的功效，具有商業(yè)價值。

表6 微生態(tài)制劑貯藏過程中活菌總數(shù)變化 g-1

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實驗，確定了復(fù)合微生態(tài)制劑保護(hù)劑的最佳配方為脫脂乳14.17%，海藻糖4.00%和甘油1.65%，在此條件下制得的微生態(tài)制劑益生菌存活率最高，可達(dá)到89.91%，其中乳酸菌數(shù)為5.60×1011g-1，酵母菌數(shù)為3.90×1011g-1，枯草芽孢桿菌數(shù)為4.20×1011g-1。制備的復(fù)合微生態(tài)制劑活菌總數(shù)高達(dá)1.37×1012g-1。儲藏期內(nèi)活菌變化可知，微生態(tài)制劑的活菌存活率在貯藏期間呈下降趨勢，但6個月后為6.0×109g-1。

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