欒生，謝雪嬌，郝雨蒙，王媛，王春梅，李慶章

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

microRNA(miRNA)是一類基因調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[1]，microRNA通過調(diào)控其靶mRNA的穩(wěn)定性和翻譯來效率調(diào)節(jié)生物學(xué)反應(yīng)[2,3]。

miR-142-3p定位于小鼠11號(hào)染色體上，研究證實(shí)miR-142-3p參與效應(yīng)T細(xì)胞的活化[4]，經(jīng)常在新生組織被檢測(cè)到[5]，miR-142-3p在胰腺癌組織表達(dá)量降低[6]，在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)與手術(shù)移植后的耐藥性有關(guān)[7]，miR-142-3p可以抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-142-3p可對(duì)泌乳相關(guān)基因Prlr進(jìn)行調(diào)控，直接或間接影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖與泌乳（資料待發(fā)表）。

為進(jìn)一步闡明miR-142-3p的體內(nèi)作用，本研究擬通過尾靜脈注射，改變miR-142-3p在小鼠乳腺中的表達(dá)量，在整體和組織學(xué)水平研究miR-142-3p對(duì)泌乳量、乳成分及乳腺組織結(jié)構(gòu)的影響，為人工調(diào)控乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：研究所選取的孕鼠均為健康的昆明小白鼠，在相同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境及飼喂條件下飼養(yǎng)。

試劑：miR-142-3p的模擬物mimics、抑制劑inhibitor、陰性對(duì)照試劑negative c ontrol均由上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)并合成。

儀器：丹麥福斯MilkScan FT120乳品成分快速檢測(cè)儀、光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 miR-142-3p過表達(dá)的影響

（1）尾靜脈注射。待孕鼠分娩后，每只母鼠配置8只仔鼠，母鼠尾靜脈注射藥物，注射劑量為100 ng/mg體重。實(shí)驗(yàn)共分3組：①過表達(dá)組：miR-142-3p的模擬物mimics；②陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照試劑negative control；③空白對(duì)照組：生理鹽水。每組設(shè)置3個(gè)平行。

（2）48 h泌乳量測(cè)定。仔鼠出生后前15日完全靠吸吮母乳生長(zhǎng)，所以稱量仔鼠體重變化，間接反應(yīng)母鼠的泌乳量變化[9]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定2日內(nèi)泌乳量。測(cè)量方法：分組及處理同1.2.1（1），以4 h為1個(gè)哺乳單位，即隔離3 h，哺乳1 h，稱量并記錄哺乳前、后仔鼠體重變化，記錄截止到第48 h，期間共測(cè)定12次，將12次所得的結(jié)果相加所得的值，即為48 h的泌乳量。

（3）乳成分分析。分組及處理同1.2.1（1），注射試劑48 h后收集母鼠乳汁，采用丹麥福斯MilkScan FT120乳品成分快速檢測(cè)儀分析不同實(shí)驗(yàn)組母鼠乳成分變化，分析的乳品質(zhì)指標(biāo)主要包括：脂肪、蛋白質(zhì)、非脂乳固體物、灰分、乳糖。

（4）乳腺組織結(jié)構(gòu)變化。分組及處理同1.2.1（1），48 h后,頸椎脫位法處死母鼠，收集第4乳區(qū)的乳腺組織，制作組織石蠟切片，之后進(jìn)行HE染色，每張切片選取5個(gè)視野觀察并計(jì)算每個(gè)視野乳腺腺泡平均數(shù)。HE染色方法：①石蠟切片用二甲苯常規(guī)脫蠟；②經(jīng)無水酒精、95%酒精、85%酒精、70%酒精逐級(jí)分化；③經(jīng)蒸餾水轉(zhuǎn)入蘇木精染色液染色10 min；④1%鹽酸酒精分化5～10 s，鏡檢，直到細(xì)胞核及核內(nèi)染色質(zhì)清晰為止；⑤氨水返藍(lán)30 s；⑥流水沖洗2 h以上；⑦伊紅浸染2 min；⑧梯度酒精脫水：依次經(jīng)過70%酒精、75%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精脫水，其中70%酒精和75%的酒精2 min,其余約3 min；⑨二甲苯透明:10 min/次，共2次；⑩中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.2 miR-142-3p抑制的影響

（1）尾靜脈注射。待孕鼠分娩后，每只母鼠配置8只仔鼠，尾靜脈注射藥物，劑量為100 ng/mg。實(shí)驗(yàn)共分3組，①抑制組：miR-142-3p的抑制劑Inhibitor；②陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照試劑negative control；③空白對(duì)照組：生理鹽水。每組設(shè)置3個(gè)平行。

（2）48 h泌乳量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.2.2（1），實(shí)驗(yàn)方法同1.2.1（2）。

（3）乳成分分析。實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.2.2（1），實(shí)驗(yàn)方法同1.2.1（2）（3）。

（4）乳腺組織結(jié)構(gòu)變化。實(shí)驗(yàn)分組及處理同1.2.2（1），實(shí)驗(yàn)方法同1.2.1（2）（4）。

2 結(jié)果

2.1 miR-142-3p過表達(dá)

2.1.1 對(duì)母鼠48 h泌乳量的影響

實(shí)驗(yàn)期間泌乳量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。注射Mimics組母鼠48 h泌乳量比于陰性對(duì)照組和空白組極顯著減少（P＜0.01）。

2.1.2 對(duì)乳成分的影響

乳成分統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示，注射Mimics組母鼠乳汁成分中的蛋白質(zhì)極顯著降低（P＜0.01），脂肪和非脂乳固體物含量顯著減少（P＜0.05），灰分和乳糖變化不顯著（P＞0.05）。

表1 miR-142-3p過表達(dá)對(duì)母鼠48 h泌乳量的影響

表2 miR-142-3p過表達(dá)對(duì)乳成分的影響 %

2.1.3 對(duì)乳腺組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果如圖1所示。尾靜脈注射Mimics之后，母鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)同陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，乳腺腺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，腺泡腔回縮。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）表明，乳腺腺泡數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。

圖1 miR-142-3p過表達(dá)后乳腺組織結(jié)構(gòu)的變化（400×）

表3 miR-142-3p過表達(dá)后乳腺腺泡數(shù)量

2.2 miR-142-3p的抑制

2.2.1 對(duì)母鼠48 h泌乳量的影響

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表4所示：注射Inhibitor組母鼠48 h泌乳量比陰性對(duì)照組和空白組極顯著增加（P＜0.01）。

表4 miR-142-3p抑制對(duì)母鼠48 h泌乳量的影響

2.2.2 對(duì)乳成分的影響

乳成分統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5所示，注射Inhibitor組母鼠乳汁成分中的蛋白質(zhì)極顯著升高（P＜0.01），脂肪和非脂乳固體物含量升高（P＜0.05），灰分和乳糖變化不顯著（P＞0.05）。

表5 miR-142-3p抑制對(duì)乳成分的影響 %

2.2.3 對(duì)乳腺組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果如圖2所示。尾靜脈注射Inhibitor之后，母鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)同陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，乳腺腺泡結(jié)構(gòu)清晰規(guī)則，腺泡腔擴(kuò)張，腺泡腔內(nèi)充滿乳汁成分。統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表6）表明，乳腺腺泡數(shù)量明顯增加（P＜0.05）。

圖2 miR-142-3p抑制后乳腺組織結(jié)構(gòu)的變化（400×）

表6 miR-142-3p抑制后乳腺腺泡數(shù)量變化

3 討論

乳腺是哺乳動(dòng)物所具有的有泌乳功能的特殊腺體，是少數(shù)的幾個(gè)可以重復(fù)經(jīng)歷生長(zhǎng)、功能分化和退化過程的器官之一[10]。乳房組織結(jié)構(gòu)由兩部分組成：一部分是由乳腺腺泡和導(dǎo)管系統(tǒng)構(gòu)成的乳腺實(shí)質(zhì)；另一部分是由結(jié)締組織和脂肪組織構(gòu)成的乳腺間質(zhì)，后者保護(hù)和支持腺體實(shí)質(zhì)。所有乳汁都是由乳腺腺泡的分泌上皮細(xì)胞生成的。每一個(gè)乳腺腺泡由一層分泌上皮細(xì)胞構(gòu)成，這些高度特化的上皮細(xì)胞是泌乳的基本單位。腺泡表面附有肌上皮細(xì)胞，它能在催產(chǎn)素的作用下產(chǎn)生收縮，使腺泡內(nèi)的乳汁排入導(dǎo)管系統(tǒng)。乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)目和活性與乳的產(chǎn)量密切相關(guān)[11]，所以增加乳腺上皮細(xì)胞數(shù)目和活性對(duì)泌乳有重要的貢獻(xiàn)，但是調(diào)節(jié)泌乳細(xì)胞數(shù)目和活性的機(jī)制仍不清楚[12]。乳汁是乳腺生理活動(dòng)的產(chǎn)物，其中含有初生幼仔生長(zhǎng)發(fā)育所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，哺乳動(dòng)物的乳汁成分很復(fù)雜，物種、食物、季節(jié)、年齡、胎次、泌乳期、個(gè)體特性等，都能影響乳汁的成分，各種哺乳動(dòng)物的乳汁都含有水、蛋白質(zhì)、脂肪、糖、無機(jī)鹽、維生素等。

本文通過對(duì)哺乳初期的昆明小白鼠尾靜脈注射miR-142-3p的模擬物及抑制劑，使miR-142-3p在整個(gè)小鼠乳腺組織中的表達(dá)量發(fā)生變化，繼而研究miR-142-3p對(duì)泌乳期乳腺以及泌乳的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射miR-142-3p的模擬物mimics之后，母鼠的泌乳量降低，組織切片HE染色結(jié)果表明小鼠乳腺腺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，腺泡數(shù)量減少，腺泡腔縮小，乳成分分析顯示出乳蛋白、脂肪、非脂乳固體物顯著減少，乳營養(yǎng)品質(zhì)降低。而注射miR-142-3p的抑制劑Inhibitor之后，小鼠泌乳量增加、泌乳期乳腺組織中腺泡規(guī)則清晰，腺泡數(shù)量增加，腺泡腔增大，乳營養(yǎng)品質(zhì)提高。

綜上所述，得出以下結(jié)論：miR-142-3p可以負(fù)向調(diào)控乳腺的發(fā)育、泌乳，并對(duì)乳營養(yǎng)品質(zhì)具有一定影響。

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