岳金金，張喜月，劉金穎，劉慧婷，張 玲

（遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

厚樸酚是從中藥厚樸中提取的一種含有酚羥基的生物活性物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、抗炎、抗菌、抑制血小板聚集和抗心律失常等多種作用，在醫(yī)藥等領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用。但厚樸酚性狀不穩(wěn)定，在水中的溶解度和分散性差，不易加工、貯藏，使其應(yīng)用受到一定的限制（沈映君，1997）。β-環(huán)糊精（β-CD）具有空腔內(nèi)徑大小適中、包合力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)易得等優(yōu)點(diǎn)，與難溶性藥物容易形成穩(wěn)定的水合物，制成的包合物具有性質(zhì)穩(wěn)定、不易揮發(fā)、有較高的水溶性和良好的分散性等特點(diǎn)，不僅能增加藥物分子的溶解度，還能提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度（安偉娟等，2008）。

本試驗(yàn)采用研磨法制備厚樸酚-β-環(huán)糊精包合物（厚樸酚-β-CD），運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化其制備工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 DZKW-4電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、FA1004N電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）、SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵 （浙江臨海市精工真空設(shè)備廠）、DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、紫外分光光度計(jì)（南京強(qiáng)拓科技有限公司）。

1.1.2 試劑 厚樸酚 （西安開來生物工程有限公司，批號(hào)：538438）；β-環(huán)糊精（中國上?；菔郎噭┯邢薰?，批號(hào)：120108）；甲醇、異丙醇、無水乙醇和石油醚均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 厚樸酚包合物的制備 參照桂卉等（2005）的方法，精密稱取β-環(huán)糊精，加入4倍量的水?dāng)嚢枞芙?，制備出?環(huán)糊精的飽和水溶液。將飽和水溶液倒入研缽中，并將研缽置于60℃恒溫水浴鍋中，研磨1 h后，待β-環(huán)糊精呈現(xiàn)糊狀后，緩慢滴加用有機(jī)溶劑溶解的厚樸酚，繼續(xù)研磨，直至再次呈現(xiàn)糊狀后使用真空泵抽濾，并用石油醚洗滌三次，干燥后備用。

1.2.2 厚樸酚-β-環(huán)糊精包合物中厚樸酚含量的測定

1.2.2.1 對照品溶液的制備 取60℃減壓干燥4 h的厚樸酚對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水甲醇（色譜純）溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，即得對照品溶液。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取適量厚樸酚，用無水乙醇稀釋成濃度為 3、5、7、9、11、13、15 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，于298 nm處測定吸光度，確定濃度（C）與吸光度（A）之間的線性關(guān)系。

1.2.2.3 含量測定 稱取厚樸酚-β-環(huán)糊精包合物1 mg，用50%乙醇溶解，定容至10 mL；再吸取1.0 mL置于10 mL容量瓶中用50%乙醇溶液稀釋并定容。在298 nm處測定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程求得厚樸酚的濃度，從而求出包合物中厚樸酚的含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 以β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時(shí)間（B）、研磨溫度（C）3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，按照1.2.1所述方法包合厚樸酚，并計(jì)算出被包合的厚樸酚的量。

1.2.3.1 β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量的影響 在研磨時(shí)間30 min、研磨溫度60℃的條件下，研究β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1 時(shí)對厚樸酚含量影響。

1.2.3.2 研磨時(shí)間對厚樸酚含量的影響 在β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例為5∶1、研磨溫度60℃的條件下，研究研磨時(shí)間分別為 10、20、30、40、50 min時(shí)對厚樸酚含量的影響。

1.2.3.3 研磨溫度對厚樸酚含量的影響 在β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例為5∶1、研磨時(shí)間30 min的條件下，研究包合溫度分別為 45、50、55、60、65 ℃時(shí)對厚樸酚含量的影響。

1.2.3.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的最優(yōu)水平基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以厚樸酚含量（Y）為響應(yīng)值，利用Design Expert 7.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)，選取β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時(shí)間（B）、研磨溫度（C）三個(gè)影響因素，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量的影響 由圖1可見，隨β-環(huán)糊精與厚樸酚比例的增加，包合物中厚樸酚的含量開始增高，當(dāng)比例達(dá)到5∶1時(shí)厚樸酚含量最高，之后開始下降。從厚樸酚含量考慮，將二者比例控制在5∶1左右為宜。

圖1 β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量影響

2.1.2 研磨時(shí)間對厚樸酚含量的影響 由圖2可見，隨著研磨時(shí)間的延長，包合物中厚樸酚含量開始增大，當(dāng)時(shí)間為30 min時(shí)，厚樸酚含量達(dá)到一定高度。之后隨著研磨時(shí)間的繼續(xù)延長，厚樸酚含量不再有明顯增加。結(jié)合實(shí)際情況考慮將研磨時(shí)間控制在30 min左右為宜。

圖2 研磨時(shí)間對厚樸酚含量影響

2.1.3 研磨溫度對厚樸酚含量的影響 由圖3可見，隨著研磨溫度的增加，厚樸酚含量增大，當(dāng)研磨溫度達(dá)到60℃時(shí)，厚樸酚含量最高，隨后又有所下降。綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和后續(xù)工藝的簡化，研磨溫度以60℃左右為宜。

2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn) 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)的取值見表2，共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。前面12個(gè)是析因點(diǎn)，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；后面3個(gè)為零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差（任濤和鐘潔，2011）。每次制得的包合物中厚樸酚含量見表2。

圖3 研磨溫度對厚樸酚含量影響

表2 厚樸酚-β-環(huán)糊精包合物制備工藝優(yōu)化方案及結(jié)果

2.2.1 回歸方程 用響應(yīng)曲面法對β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時(shí)間（B）、研磨溫度（C）進(jìn)行三因素三水平的分析，確定制備包合物的最佳條件，結(jié)果見表2。利用軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=20.50-0.34A+0.15B+0.038C-0.22AB-0.40AC-0.33BC-1.85A2-0.77B2-0.30C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 由表3結(jié)果可知，方程一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2、B2和交互項(xiàng)中AC對厚樸酚含量的影響均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），二次項(xiàng)C2和交互BC對厚樸酚含量的影響顯著 （P＜0.05），其余項(xiàng)均不顯著。

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 利用Design Expert 7.0軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，建立響應(yīng)曲面，結(jié)果如圖4所示。

圖4a反映地是研磨溫度為60℃時(shí)，β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例和研磨時(shí)間對厚樸酚-β-環(huán)糊精包合物中厚樸酚含量的影響。當(dāng)β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例較低時(shí)，厚樸酚含量隨著研磨時(shí)間的增加先增加后減小，當(dāng)比例接近5∶1、時(shí)間接近30 min時(shí)，厚樸酚含量達(dá)到最大值。

表3 回歸模型方差分析

圖4b反映地是研磨時(shí)間為30 min，β-CD與厚樸酚的比例和研磨溫度對包合物中厚樸酚含量的影響。包合物中厚樸酚含量隨β-CD與厚樸酚的比例的增加而快速增加，當(dāng)比例在5∶1附近、研磨溫度大于60℃時(shí)可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。

圖4c反映地是β-CD與厚樸酚的比例為5∶1時(shí)，研磨溫度和研磨時(shí)間對厚樸酚含量的影響。結(jié)合圖中曲線走勢可見，曲線相對較陡，兩因素的交互作用對厚樸酚含量的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.4 確定最優(yōu)條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 通過軟件分析得到厚樸酚-β-CD的最優(yōu)條件為：研磨溫度60.81℃、研磨時(shí)間30.96 min、β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例為4.89∶1，此時(shí)模型預(yù)測厚樸酚含量為20.59%。考慮實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件修改為包合溫度61℃、包合時(shí)間31 min、β-環(huán)糊精與厚樸酚的比例為4.9∶1。在此修正條件下進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，厚樸酚-β-CD包合率的平均值為20.27%，RSD為0.47%，與理論預(yù)測值（20.59%）相比誤差為0.32%。

3 討論與結(jié)論

由回歸模型方差分析結(jié)果可知：模型P＜0.01，說明本次試驗(yàn)的響應(yīng)回歸模型具有極顯著水平；模型的校正系數(shù)R2＞0.99，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性非常好；R2Adj的數(shù)值表示該模型能解釋97.36%響應(yīng)值的變化，試驗(yàn)誤差小，可以很好地描述β-CD與厚樸酚的比例、研磨時(shí)間、研磨溫度與厚樸酚-β-CD包合率的真實(shí)關(guān)系。方程一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的P值表明各個(gè)因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系，而具有一定的交互作用，采用響應(yīng)曲面法進(jìn)行的優(yōu)化試驗(yàn)所得回歸方程模型可以用來分析預(yù)測厚樸酚-β-CD的包合結(jié)果。得出最佳工藝條件為：研磨溫度61℃、研磨時(shí)間31 min、β-環(huán)糊精與厚樸酚比例為 4.9∶1。通過在最佳條件下的驗(yàn)證試驗(yàn)表明，厚樸酚-β-CD包合物中厚樸酚含量為20.27%。可見運(yùn)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化厚樸酚-β-CD的制備工藝可以獲得最大的厚樸酚含量，參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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[3]任濤，鐘潔.響應(yīng)曲面法優(yōu)化超聲波輔助提取蒲公英糖蛋白工藝[J].食品工業(yè)科技，2011，32（7）：297～302.

[4]沈映君.中藥藥理學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1997.83.