牛淑冬，卓瑪次仁，張彬，崔超英，格桑羅布，邊巴，朱鵬程，張明濤，佟偉軍，孫玉晶，岑維浚，李靜平，邱長春

[1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，西藏 拉薩 850000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），北京 100005；4.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西藏 拉薩 850000；5.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830054；6.新疆阿勒泰地區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 阿勒泰 836500；7.內(nèi)蒙古通遼衛(wèi)生防疫站，內(nèi)蒙古 通遼 028000]

·臨床論著·

血管緊張素原基因多態(tài)性與中國部分少數(shù)民族原發(fā)性高血壓的相關(guān)性*

牛淑冬1，卓瑪次仁2，張彬3，崔超英4，格桑羅布2，邊巴4，朱鵬程5，張明濤6，佟偉軍7，孫玉晶3，岑維浚2，李靜平1，邱長春1

[1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.西藏自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，西藏 拉薩 850000；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），北京 100005；4.西藏大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，西藏 拉薩 850000；5.新疆醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 烏魯木齊 830054；6.新疆阿勒泰地區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，新疆 阿勒泰 836500；7.內(nèi)蒙古通遼衛(wèi)生防疫站，內(nèi)蒙古 通遼 028000]

目的研究血管緊張素原（AGT）基因多態(tài)性位點(diǎn)M235T、A-6G、A-20C及其單倍型（M235T-A-6GA-20C）與中國部分原發(fā)性高血壓（EH）高發(fā)的少數(shù)民族（蒙古族、哈薩克族、藏族）EH易感性的關(guān)系，比較AGT對不同民族人群EH發(fā)病風(fēng)險的影響。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）技術(shù)判定基因型，采用Haploview軟件進(jìn)行單倍型分布分析。結(jié)果哈薩克族EH組-6G分布顯著高于對照組（42.34%vs 36.98%，P=0.009）。藏族EH組20C分布顯著低于對照組（18.17%vs23.19%，P=0.038）。哈薩克族EH組M-A-A的分布頻率顯著低于對照組（38.16%vs 47.50%，P=0.001），而EH組M-G-A分布頻率顯著高于對照組（16.20%vs 8.61%，P=0.000）。藏族EH組T-A-A分布頻率顯著高于對照組（71.89%vs 64.15%，P=0.006）。結(jié)論AGT多態(tài)性與EH的相關(guān)性具有顯著的種族異質(zhì)性，M235T、A-6G、A-20C與中國蒙古族EH發(fā)病風(fēng)險無關(guān)，-6G與哈薩克族EH易感性升高相關(guān)，而20A可能降低藏族EH的發(fā)病風(fēng)險；單倍型M-G-A和T-A-A可能分別與哈薩克族和藏族EH易感性升高相關(guān)，而M-A-A可能是哈薩克族抗EH的保護(hù)性因素。

原發(fā)性高血壓；血管緊張素原基因；基因多態(tài)性；單倍型；中國少數(shù)民族

流行病學(xué)調(diào)查顯示，原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）在中國各民族的發(fā)病率差異較大，生活在高原地區(qū)或北方的藏族、哈薩克族和蒙古族等患病率較高，生活在南方或非高原地區(qū)的苗族、壯族等患病率則較低[1]。2002年統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，藏族EH患病率（24.7%）為中國各民族之首，哈薩克族為18.97%，蒙古族為17.6%?；疾÷实牟町惐砻鞲髅褡迦巳旱腅H易患性、易感性不同，因此對不同民族人群開展EH的分子遺傳學(xué)研究，對加強(qiáng)EH預(yù)防、探索EH個體化診斷與治療具有重要意義。

血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的初始底物，在腎素的作用下水解為血管緊張素Ⅰ，后者在其他酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ、Ⅲ，影響水、鹽代謝及血管阻力，進(jìn)而影響血壓[2]。AGT基因位于染色體1q42、43區(qū)，全長1 030 bp。由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，是最早發(fā)現(xiàn)，也是目前為止研究最多的EH候選基因。大量研究表明AGT單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）與EH有關(guān)，但研究結(jié)果并不一致[3]，中國各地區(qū)、各民族的研究結(jié)果也各不相同，提示AGT多態(tài)性與EH的相關(guān)性具有顯著的種族異質(zhì)性[4-5]。

本文總結(jié)課題組多年來以人群為基礎(chǔ)的病例-對照研究結(jié)果，分別探討A-6G、A-20C、M235T 3個多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因、基因型、單倍型分布頻率與蒙古族、哈薩克族及藏族EH相關(guān)性，旨在比較分析AGT基因在中國部分EH高發(fā)的民族、地區(qū)對EH發(fā)病風(fēng)險的影響。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

引物購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司，Mycycler Thermal Cycler擴(kuò)增儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，直接測序委托北京華大中生科技發(fā)展有限公司完成。

1.2 研究對象

研究對象為≥3代居住于所在地區(qū)的長期穩(wěn)定居民，與其他民族無通婚史。EH患者入選標(biāo)準(zhǔn)采用《1999年WHO/ISN高血壓治療指南》：①收縮壓（systolic pressure，SBP）≥140 mmHg和/或舒張壓（diastolic pressure，DBP）≥90 mmHg；②20～60歲發(fā)?。虎叟懦^發(fā)性高血壓、糖尿病、腎病等慢性疾病；④未進(jìn)行抗高血壓藥物治療。按性別、年齡、職業(yè)匹配選擇正常對照人群，年齡＞40歲，SBP≤130 mmHg和DBP≤80 mmHg。該項(xiàng)研究獲得齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有參加調(diào)查對象簽署知情同意書。

各民族研究對象及所在地區(qū)如下：①蒙古族：EH組243例，對照組258例，全部來自內(nèi)蒙古自治區(qū)；②哈薩克族：EH組521例，對照組623例，全部來自新疆阿勒泰地區(qū)；③藏族：EH組333例，對照組235例，全部來自西藏自治區(qū)拉薩市。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組制備采集外周靜脈血5 ml，采用低滲法破除紅細(xì)胞，酚-氯仿抽提法抽提、純化。DNA純度達(dá)A260∶A280≥1.80。

1.3.2 基因分型采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)判斷基因型，并隨機(jī)選取10%的樣本直接測序，驗(yàn)證PCR-RFLP分型的準(zhǔn)確性。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)引物序列：A-20C（rs5050）和A-6G（rs5051），正向引物：AGAAATCCCAGCGTGAGTGT，反向引物：AGAC CAGAAGGAGCTGAGGG；M235T（rs699），正向引物：CAGGGTGGTCCACACTGGACCCC，反向引物：CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTCT。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)體系內(nèi)含10×PCR緩沖液，200μmol/L dNTPs，10 pmol引物，50 ng模板DNA，Taq聚合酶1 u。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。各取每種PCR產(chǎn)物5μl，分別采用內(nèi)切酶Eco109Ⅰ、BstNI、TthⅢ，按推薦條件進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)，以鑒定A-20C、A-6G、M235T基因型。酶切產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等位基因和基因型頻率估算用直接基因計(jì)數(shù)法，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因型與等位基因頻率分布

蒙古族人群中，M235T、A-6G、A-20C在EH組和對照組的基因型及等位基因分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哈薩克族人群中，A-6G在EH組和對照組的基因型分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.010），且-6G在EH組的分布頻率顯著高于對照組（P=0.009）。藏族人群中，EH組-20C分布頻率顯著低于對照組（P=0.038）。見表1。

表1 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因型/等位基因頻率分布

2.2 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因的M235T-A-6G-A-20C單倍型分布頻率

蒙古人群中有6種分布頻率＞1%的單倍型，各單倍型在EH組和對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。哈薩克族人群中有6種分布頻率＞1%的單倍型，其中M-A-A在EH組的分布頻率顯著低于對照組（P=0.001），而M-G-A在EH組分布頻率顯著高于對照組（P=0.000）。藏族人群中有8種分布頻率＞1%的單倍型，其中T-A-A在EH組分布頻率顯著高于對照組（P=0.006），而M-G-A和T-A-C分布頻率顯著低于對照組（P＜0.05）；但經(jīng)嚴(yán)格的Bonferroni校正后，M-G-A和T-A-C在藏族EH組和對照組的分布頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

續(xù)表1

表2 蒙古族、哈薩克族、藏族人群AGT基因M235T-A-6G-A-20C單倍型分布頻率%

3 討論

AGT基因中，位于第2外顯子的M235T是外顯子中最重要的多態(tài)性位點(diǎn)之一。據(jù)文獻(xiàn)報道，M235T與白種人、日本人EH相關(guān)[3]，與血漿AGT水平相關(guān)，235TT純合子較235MM純合子EH易感性升高11%[6]。但本研究中，M235T與中國藏族、哈薩克族、蒙古族EH易感性無明顯相關(guān)。該結(jié)果與孔祥東等[5]的研究結(jié)果一致，但與WANG等[4]的研究結(jié)果不符。由于M235T不是AGT蛋白的酶切位點(diǎn)，不會影響AngⅡ的生成；同時M235T并不影響AGT基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此有研究者認(rèn)為，M235T可能是附近與EH有關(guān)的突變的遺傳標(biāo)記，M235T多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)是通過血管緊張素原基因核心啟動子（angiotensinogen core promoter element 1，AGCE1）序列介導(dǎo)的。AGCE1位于TATA盒和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間，可結(jié)合一種廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子AGT核心啟動子結(jié)合因子1（human AGT gene core promoter element binding factor 1，AGCF1），對AGT轉(zhuǎn)錄起始及基因表達(dá)方式產(chǎn)生重要影響[7]。該區(qū)域的A-6G、A-20C與M235T位點(diǎn)完全連鎖不平衡[8]，其中A-6G直接影響AGT基因基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄速率，A-20C變異影響人體血漿中AGT和血管緊張素Ⅱ的水平，上述變異均與EH顯著相關(guān)。

在中國各民族人群中，A-6G、A-20C多態(tài)性與EH的關(guān)聯(lián)具有明顯的民族差異性[5，9]。本研究中，A-20C與蒙古族、哈薩克EH組無明顯相關(guān)，該結(jié)果與孔祥東等[5]的研究結(jié)果一致，但在藏族人群中，EH組-20C分布頻率顯著低于對照組，提示C等位基因可能是藏族人群EH的抗性因素。目前，關(guān)于A-6G的報道尚無一致結(jié)果，李南方等[10]報道-6G變異與哈薩克族EH有關(guān)；LIU等[9]報道，A-6G與漢族和彝族的EH無關(guān)聯(lián)；本研究結(jié)果顯示，-6G與哈薩克族EH顯著相關(guān)，可能是哈薩克EH的風(fēng)險因子。上述研究結(jié)果的矛盾可能由多種因素造成。首先，AGT合成受多種因素調(diào)控，如AGT基因5'-端非編碼區(qū)的雌激素、糖皮質(zhì)激素、甲狀腺素和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控元件，啟動子附近區(qū)域的AGE2和AGE3順式作用元件等[11]，擴(kuò)大研究位點(diǎn)的范圍可能更有助于揭示不同種族、不同民族AGT基因多態(tài)性在EH發(fā)病中的作用。此外，由于性別的分層原因?qū)е碌募訇P(guān)聯(lián)、上位效應(yīng)也是不易排除的因素。

對于蒙古、哈薩克、藏族AGT基因單倍型的研究結(jié)果顯示，含有A-20C-A-6G-M235T多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型與蒙古族EH無關(guān)；攜帶M-G-A的哈薩克族和攜帶T-A-A的藏族人群患EH風(fēng)險顯著升高，提示上述兩種單倍型可能是哈薩克族和藏族人群的EH風(fēng)險因子；而M-A-A在哈薩克族EH組中的分布頻率顯著低于對照組，表明該單倍型可能是哈薩克族人群的保護(hù)性因素。單倍型M-A-A與M-G-A比較，其差異僅在A-6G位點(diǎn)不同，說明A-6G位點(diǎn)在A-20C-A-6G-M235T單倍型中起很強(qiáng)作用。該結(jié)果與哈薩克族單個基因分析的結(jié)果相互支持，提示作為AGT基因核心啟動子區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)，A-6G是哈薩克族人群EH的一個重要影響因子。

本研究表明，同一多態(tài)性位點(diǎn)對不同民族EH發(fā)病的影響不同，進(jìn)一步提示EH病因?qū)W的遺傳異質(zhì)性和揭示不同民族EH遺傳學(xué)基礎(chǔ)的必要性。本項(xiàng)研究的優(yōu)勢在于參與者均生活于環(huán)境較為封閉、人群流動性小的地區(qū)，遺傳背景單純，可有效代表所研究人群的遺傳特性，提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和和可信度。不足在于樣本量偏小，研究的位點(diǎn)有限，未能測定AGT的血漿濃度。需要擴(kuò)大樣本量及研究位點(diǎn)的范圍以進(jìn)一步明確AGT基因多態(tài)性對于中國各民族EH發(fā)病的影響。

[1]蘇秀蘭,常培葉.中國少數(shù)民族原發(fā)性高血壓候選基因研究進(jìn)展[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(11):1621-1623.

[2]DAVID F,FRIEDRICH CL,MICHAELI B,et al.Emergence and evolution of the rennin-angiotensin-aldosterone system[J].J Mol Med,2012,90(5):495-508.

[3]ARMANI C,BOTTO N,ANDREASSI MG.Susceptibility genes in hypertension[J].Current Pharmaceutical Design,2011,17(28): 2973-2986.

[4]WANG GY,WANG YH,XU Q,etal.Associations between RAS Gene polymorphisms,environmental factors and hypertension in Mongolian people[J].Eur J Epidemiol,2006,21(4):287-292.

[5]孔祥東,楊宇霞,張思仲.AGT基因單倍型與原發(fā)性高血壓[J].遺傳, 2004,26(6):797-802.

[6]SETHI AA,NORDESTGAARD BG,HANSEN AT.Angiotensinogen gene polymorphism,plasma angiotensinogen,and risk of hypertension and ischemic heart disease:a meta-analysis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2003,23(7):1269-1275.

[7]ARMANI C,BOTTO N,ANDREASS MG.Susceptibility genes in hypertension[J].Curr Pharm Des,2011,17(28):2973-2986.

[8]JIALD,ZHANGLN,SHENP,etal.AssociationofangiotensinogengeneM235Tandangiotensin-convertingenzyme gene I/D polymorphisms with essential hypertension in Han Chinese population:a meta-analysis[J].Journal of Hypertension,2010, 28(3):419-428.

[9]LIU Y,QIN W,HOU S,et al.A-6G variant of the angiotensinogen gene and essential hypertension in Han,Tibetan, and Yi populations[J].Hypertens Res,2001,24(2):159-163.

[10]李南方,周玲,吳衛(wèi)東.血管緊張素原基因5'-端核心啟動子區(qū)（-6）AG和（-20）A-C變異與哈薩克族人原發(fā)性高血壓相關(guān)性分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2004,21(1):23-27.

[11]THOMAS GN,YOUNG RP,TOMLINSON B,et al.Renin-angiotensin-aldosterone system gene polymorphisms and hypertension in HongKong Chinese[J].Clin Exp Hypertension,2000,22(1): 87-97.

（申海菊 編輯）

Association between angiotensinogen gene polymorphisms and essential hypertension in a part of Chinese minorities*

Shu-dong NIU1,Ci-ren ZHUO-MA2,Bin ZHANG3,Chao-ying CUI4,Luo-bu GE-SANG2, Ba BIAN4,Peng-cheng ZHU5,Ming-tao ZHANG6,Wei-jun TONG7,Yu-jing SUN3, Wei-jun CEN2,Jing-ping LI1,Chang-chun QIU1
[1.College of Basic Medical Sciences,Qiqihar Medical University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,P.R.China;2.Department of Cardiology,the People's Hospital of Tibet Autonomous Region,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;3.Institute of Basic Medical Sciences(National Laboratory of Medical Molecular Biology),Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100005,P.R.China;4.Institute of High Altitude Sickness,Medical College, Tibet University,Lhasa,Tibet Autonomous Region 850000,P.R.China;5.Department of Cardiology,the Fourth Affiliated Hospital,Xinjiang Medical University,Urumuqi,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 830054,P.R.China;6.Department of Cardiology,Altay RegionPeople's Hospital,Aletai,Xinjiang Uyghur Autonomous Region 836500,P.R.China; 7.Tongliao Sanitation and Antiepidemic Station,Tongliao,Inner Mongolia Autonomous Region 028000,P.R.China]

【Objective】To study the association between angiotensinogen gene(AGT)polymorphic site M235T,A-6G,A-20C and the haplotype(M235T-A-6G-A-20C)and the susceptibility to essential hypertension(EH)in a part of high-risk minorities in China including Mongolian,Kazakh and Tibetan,and to compare the effect of AGT gene variations on EH in different minorities.【Methods】The polymorphisms were genotyped by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP),the haplotype distribution was analyzed by Haploview software.【Results】In single locus study,the distribution of-6G was significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects(42.34%vs 36.98%,P=0.009)in Kazakhs；the distribution of-20C was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects (18.17%vs 23.19%,P=0.038)in Tibetans.In haplotype analysis,the distribution of M-A-A was significantly lower in the EH subjects than in the normal subjects(38.16%vs 47.50%,P=0.001)in Kazakhs,while the distributions of M-G-A and T-A-A were significantly higher in the EH subjects than in the normal subjects in Kazakhs and Tibetans,respectively(M-G-A:16.20%vs 8.61%,P=0.000；T-A-A:71.89%vs 64.15%,P= 0.006).【Conclusions】The correlation between AGT polymorphisms and EH has showed significant ethnic heterogeneity.M235T,A-6G and A-20C are not associated with the susceptibility to EH in Mongolian population.-6G is associated with the increased risk of EH in Kazakhs；-20C may decrease the risk of EH in Tibetans.Haplotype M-G-A and T-A-A may increase the genetic susceptibility to EH in Kazakhs and Tibetans,respectively,and M-A-A may be a protective haplotype for Kazakhs.

essentialhypertension；angiotensinogengene；genepolymorphism；haplotype；Chinese minority

R394；R34

A

1005-8982（2015）29-0044-05

2015-03-09

國家自然科學(xué)基金（No：31171146；31371208；30393132）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（973計(jì)劃）（No：2006BAII9B07）

邱長春，E-mail：changchun_qiu@163.com；Tel：0452-2663389