王媛媛，邱曉陽，況麗平，吳智勇，姚曉東，杜則澎，王少洪，沈金輝，*

（1. 汕 頭市中心醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041；2. 汕頭市中心醫(yī)院腫瘤外科，廣東 汕頭 515041）

CD44v6和Ezrin與大腸腺瘤癌變及預(yù)
后的關(guān)系

王媛媛1，邱曉陽1，況麗平1，吳智勇2，姚曉東2，杜則澎1，王少洪1，沈金輝1，*

（1. 汕 頭市中心醫(yī)院病理科，廣東 汕頭 515041；2. 汕頭市中心醫(yī)院腫瘤外科，廣東 汕頭 515041）

隨著人們生活水平提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，大腸腺癌發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，從第6位上升到第2位，其中，腺瘤癌變途徑是大腸腺癌發(fā)生的經(jīng)典途徑。通過預(yù)警分子早期發(fā)現(xiàn)具有癌變潛能的腺瘤并有效手術(shù)切除能達(dá)到早期發(fā)現(xiàn)并減少癌變率，從而減少大腸腺癌患者的死亡率，但是目前尚缺乏可靠的癌變分子標(biāo)記。最近研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜表面蛋白CD44v6和骨架連接蛋白家族成員Ezrin，參與多種生長因子及受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本文對二者在大腸腺瘤癌變過程中的表達(dá)特點(diǎn)及其與臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

收集汕頭市中心醫(yī)院2008-2009年大腸腺癌手術(shù)標(biāo)本80例，距癌組織5 cm以上切緣正常結(jié)腸黏膜組織20例，腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變40例。收集2008-2013年間大腸腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變20例（除家族性結(jié)腸息肉病及幼年性息肉病外），患者不同時伴有大腸腺癌，且異型細(xì)胞未突破黏膜肌層。腺癌組織中男56例，女24例；50歲以上62例，≤50歲18例；高分化17例，中低分化63例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；浸潤漿膜層63，未浸潤漿膜層17例；TNM分期I～I(xiàn)I期35例，III～I(xiàn)V期45例。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，標(biāo)本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師審核。所有標(biāo)本經(jīng)10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片。隨訪從手術(shù)之日開始，術(shù)后每年隨訪1次，患者因大腸腺癌死亡定義為完全數(shù)據(jù)，末次隨訪日為2013年9月15日，本組患者的隨訪時間均大于5年，隨訪截止時有22例死亡。

1.2 方法

鼠抗人單克隆抗體CD44v6（克隆號2F10）、鼠抗人單克隆抗體Ezrin（克隆號3c18）和即用型非生物素免疫組化EliVisionTM檢測試劑盒均購自福州邁新生物公司。采用免疫組化二步法，具體步驟按照試劑說明書進(jìn)行，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)3 min，一抗在4 ℃過夜，用已知的陽性切片作為陽性對照，用0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及整張切片中陽性細(xì)胞數(shù)占整張切片數(shù)量的百分比綜合判定。在400倍光鏡下（腫瘤細(xì)胞著色區(qū)域，順序移動玻片）隨機(jī)選取5個視野，細(xì)胞質(zhì)無著色為0分，淡黃染色為1分，棕黃色為2分，棕褐色或胞質(zhì)內(nèi)棕黑色顆粒為3分；細(xì)胞陽性數(shù)目＜5%為0分，≥5%～25%為1分，≥25%～50%為2分，≥50%～75%為3分，≥75%為4分。計算5個視野的平均分?jǐn)?shù)，將染色強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)量分?jǐn)?shù)相乘，4分及以上記為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗，運(yùn)用Kaplan-Meier法對CD44v6和Ezrin表達(dá)和生存時間進(jìn)行Log-rank檢驗，將各個單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的因素進(jìn)行Cox多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 CD44v6和Ezrin在大腸腺癌組織中的表達(dá)

CD44v6和Ezrin在正常黏膜僅見少量胞質(zhì)中有表達(dá)，而在癌組織中胞質(zhì)及胞膜表達(dá)呈棕黃色、顆粒狀。二者在大腸正常黏膜組、腺瘤伴低級別、高級別上皮內(nèi)瘤變和腺癌組CD44v6及Ezrin的表達(dá)率逐漸增強(qiáng)，腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變和腺癌組表達(dá)高于正常大腸黏膜及腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1及表1。

2.2 CD44v6和Ezrin與大腸腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

大腸腺癌組CD44v6及Ezrin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、浸潤漿膜層組和III～I(xiàn)V期表達(dá)分別高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、未侵犯漿膜層組和I～I(xiàn)I期，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），在不同性別、年齡和分化程度組間表達(dá)差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 CD44v6和Ezrin表達(dá)與大腸腺癌生存時間的相關(guān)性

CD44v6及Ezrin陰性表達(dá)的患者生存時間明顯長于陽性表達(dá)的患者。生存曲線趨勢也表明，CD44v6和Ezrin陽性表達(dá)對患者生存時間有明顯的影響（Log-rank= 18.587，P=0.000；Log-rank=7.804，P=0.005），見圖2。

2.4 Cox 風(fēng)險回歸模型分析大腸腺癌患者生存時間的影響因素

運(yùn)用Cox風(fēng)險回歸模型對影響患者生存期的臨床病理指標(biāo)及多因素分析表明，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、CD44v6表達(dá)是影響患者生存時間的獨(dú)立風(fēng)險因素，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化、CD44v6陽性表達(dá)的患者生存時間分別明顯短于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化和CD44v6陰性表達(dá)的患者，見表3。

2.5 CD44v6及Ezrin在大腸腺癌中表達(dá)的相關(guān)性分析

CD44v6和Ezrin在大腸腺癌中的雙陽性表達(dá)為34例，雙陰性表達(dá)25例，二者表達(dá)呈正相關(guān)（r=4.567，P＜0.01）。

3 討 論

最近研究發(fā)現(xiàn)CD44v6是一種廣泛表達(dá)的I型跨膜受體糖蛋白，主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，影響干細(xì)胞行為，參與細(xì)胞增殖、遷移及血管生成等行為［1-2］。Ezrin蛋白是ERM（Ezrin，Radixin，Moesin）家族的一員，常與Moesin，Radixin共同表達(dá)于細(xì)胞膜內(nèi)面，將細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜表面蛋白CD44v6連接起來，維持細(xì)胞形態(tài)和功能［3］。Ezrin參與到腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)，如從原發(fā)灶脫落、侵入周邊組織、侵入脈管系統(tǒng)、穿過基底膜、選擇性地在靶器官增殖形成轉(zhuǎn)移灶等。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)CD44v6和Ezrin在正常大腸黏膜僅見少量表達(dá)，在腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變、腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變、腺癌組織中表達(dá)率逐漸增高，二者在腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變及腺癌組中的表達(dá)高于正常黏膜及腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變，且在同一標(biāo)本中形態(tài)異型性顯著、低分化的部分表達(dá)較強(qiáng)，正常黏膜以及輕度異型部分表達(dá)較弱或者不表達(dá)。Gschwantler-Kaulich等［4］研究也發(fā)現(xiàn)Ezrin在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)增強(qiáng)。在前列腺浸潤性腺癌中的表達(dá)率高于導(dǎo)管上皮乳頭狀瘤及上皮內(nèi)瘤變［5］。綜合以上研究表明CD44v6及Ezrin可能在癌變的過程中表達(dá)逐漸增強(qiáng)，是癌變的早期事件。因此，檢測CD44v6和Ezrin的表達(dá)水平可能對大腸腺瘤癌變預(yù)測有參考價值。

本研究發(fā)現(xiàn)CD44v6及Ezrin在大腸腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，有漿膜層浸潤組，III～I(xiàn)V期的陽性表達(dá)分別高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移、無漿膜層浸潤及I-II期。Logrank檢驗顯示CD44v6及Ezrin明顯影響患者5年生存時間，CD44v6 及Ezrin陽性表達(dá)組生存時間明顯短于陰性組，并且Cox多因素分析顯示CD44v6表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后危險因素。研究者在頭頸部腫瘤研究［6-7］發(fā)現(xiàn)CD44v6表達(dá)增強(qiáng)及特定位點(diǎn)CD44v6表達(dá)的增加與患者5年總生存率、細(xì)胞分化及TNM分期之間具有相關(guān)性。在非小細(xì)胞肺癌的Meta分析中顯示CD44v6與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、生存時間有關(guān)，推測它可能在非小細(xì)胞肺癌中是不良預(yù)后指標(biāo)［8］。以上研究均表明CD44v6和Ezrin不僅是癌變的早期事件，在浸潤轉(zhuǎn)移的過程中也有促進(jìn)作用。檢測二者的表達(dá)水平有可能成為預(yù)測腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)記物［9］。本研究還發(fā)現(xiàn)CD44v6與Ezrin的表達(dá)呈正相關(guān)，表明Ezrin可能與CD44相互作用促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移。本人在前期胃癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)Ezrin表達(dá)高于正常黏膜，且在癌組織浸潤灶邊緣表達(dá)增強(qiáng)，與上皮細(xì)胞骨架蛋白E-cadherinβ-catenin復(fù)合體的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示Ezrin可能與細(xì)胞膜表面蛋白發(fā)揮作用改變細(xì)胞骨架蛋白，從而促進(jìn)腫瘤浸潤 轉(zhuǎn) 移。

綜上所述，CD44v6和Ezrin的表達(dá)與大腸腺瘤癌變、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，聯(lián)合檢測CD44v6和Ezrin的表達(dá)對判斷大腸腺瘤癌變及預(yù)后有參考價值。

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The expressions of CD44v6 and Ezrin are correlated with colorectal adenoma carcinogenesis and prognosis

WANG Yuanyuan1，QIU Xiaoyang1，KUANG Liping1，WU Zhiyong2，YAO Xiaodong2，DU Zepeng1，WANG Shaohong1，SHEN Jinhui1，*
（1. Department of Pathology， Shantou Central Hospital， Shantou 515041； 2. Department of Surgical Oncology， Shantou Central Hospital， Shantou 515041， Guangdong， China）

目的： 探討CD44v6和Ezrin在大腸腺瘤癌變中的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系。方法：應(yīng)用免疫組化檢測CD44v6和Ezrin蛋白在大腸腺癌（80例）、腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變（40例）、腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變（20例）及正常黏膜（20例）中的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理指標(biāo)及生存時間的關(guān)系。結(jié)果：CD44v6和Ezrin在腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變和腺癌組的表達(dá)高于正常黏膜及腺瘤伴低級別上皮內(nèi)瘤變組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。二者在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組、有漿膜層浸潤組、III～I(xiàn)V期的表達(dá)分別高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組、無漿膜層浸潤組及I～I(xiàn)I期，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。CD44v6和Ezrin表達(dá)與患者生存時間相關(guān)（Log-rank= 18.587，P＜0.05；Log-rank=7.804，P＜0.05）。Cox回歸多因素分析顯示CD44v6是獨(dú)立的預(yù)后危險因素（HR：7.582，95% CI： 1.605～ 35.815，P=0.011）。結(jié)論：CD44v6和Ezrin的表達(dá)與大腸腺瘤癌變、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，聯(lián)合檢測CD44v6和Ezrin的表達(dá)對判斷大腸腺瘤癌變及預(yù)后具有參考價值。

大腸腺瘤；CD44v6；Ezrin；免疫組織化學(xué)

OBJECTIVE:We explored the expressions of CD44v6 and Ezrin in colorectal adenoma carcinogenesis and their correlations with clinicopathological factors and prognosis.METHODS：Immunohistochemistry for CD44v6 and Ezrin were performed in normal mucosa（20 cases），low grade adenoma tissues（40 cases） ，high grades adenoma tissues（20cases） and colorectal cancer（80 cases）. The correlations between expressions of CD44v6 and Ezrin with survival time and clinicopathological factors were evaluated.RESULTS：Expressions of CD44v6 and Ezrin in high grades colorectal adenomas and adenocarcinoma groups were higher than normal mucosa and low grade colorectal adenoma groups（P＜0.01）. Expressions were higher in lymph node metastasis group，serosal infiltration group，stages III-IV group than no lymph node metastasis group，no serosal infiltration and stages I-II group. CD44v6 and Ezrin were significantly correlated with survival time（Logrank=18.587，P＜0.05；Log-rank=7.804， P＜0.05）. Cox regression analysis showed that CD44v6 was an independent risk factor for prognosis （HR：7.582，95%CI：1.605-35.815，P=0.011）.CONCLUSION：The expressions of CD44v6 and Ezrin w ere c orrelated w ith p rocess o f c olorectal a denoma-carcinoma t ransition，invasion a nd m etastasis. I t w ould b e v aluable t o combine C D44v6 a nd E zrin t o p redict m alignant t ransformation o f c olorectal a denoma a nd p rognosis.

colorectal adenomas；CD44v6；Ezrin；immunohistochemistry

R735.3+4

A

1004-616X（2015）01-0035-04

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.008

2014-10-04；

2014-12-15

2010年汕頭市科技計劃項目（汕府［2014］62號）

作者信息： 王媛媛，E-mail：315075516@qq.com。*通信作者， 沈金輝，E-mail：jinhuishen@tom.com