吳李飛，郝佳潔，張彤彤，梁建偉，王 征，張 鈺，徐 昕，蔡 巖，王明榮，*，李 敏，*

（1. 安 徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；3. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及其預(yù)后判斷價(jià)值

吳李飛1，郝佳潔2，張彤彤2，梁建偉3，王 征3，張 鈺2，徐 昕2，蔡 巖2，王明榮2，*，李 敏1，*

（1. 安 徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安慶市立醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003；2. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；3. 中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所腹部外科，北京 100021）

結(jié)直腸癌是世界第3大惡性腫瘤，其全球每年新發(fā)病例超過130萬，死亡人數(shù)約70萬，而在我國其發(fā)病率和死亡率均已分別達(dá)第4和第5位，且近年來發(fā)病人數(shù)呈明顯上升趨勢(shì)［1］，對(duì)人民的生命健康構(gòu)成重大威脅。目前，結(jié)直腸癌的主要治療手段是外科手術(shù)切除，術(shù)后輔助放化療等以提高根治率，但由于局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素的影響，結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間及生活質(zhì)量仍不容樂觀。為此，檢測(cè)結(jié)直腸腫瘤中的分子改變，挖掘與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，探索對(duì)某種治療方法敏感個(gè)體的共同特征將可能有助于對(duì)不同生物學(xué)特征的結(jié)直腸癌患者實(shí)施個(gè)體化治療，改善預(yù)后。

UHRF1（ubiquitin-like PHD and ring finger domains 1），即泛素樣含PHD和環(huán)指域1，是近年新發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞生長有關(guān)的核蛋白基因，其編碼的蛋白又稱ICBP90/NP95，由類泛素（ubiquitin-like，UBL）模體、PHD（plant homeodomain）結(jié)構(gòu)域、鋅指模體（zinc finger motif）和SET-環(huán)指狀結(jié)構(gòu)域（SET-and ring-associated domain，SRA）4部分組成［2］。UHRF1的表達(dá)與細(xì)胞的分化程度和增殖能力相關(guān)，即分化程度越低、增殖能力越強(qiáng)，UHRF1的表達(dá)水平也越高，例如外周血白細(xì)胞和中樞神經(jīng)細(xì)胞等高分化非腫瘤細(xì)胞中未見UHRF1表達(dá)，而在胎兒和成人胸腺、胎肝、睪丸和骨髓等增殖細(xì)胞中UHRF1的表達(dá)水平較高［3］。近來文獻(xiàn)報(bào)道，該蛋白在肺癌［4-5］、乳腺癌［6］、膀胱癌［7］、前列腺癌［8］、胃癌［9］、甲狀腺癌［10］和喉鱗癌［11］等多種腫瘤組織中上調(diào)，其高表達(dá)與肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］患者的術(shù)后生存時(shí)間負(fù)相關(guān)，且均為獨(dú)立預(yù)后因子。

Kofunato等［12］在結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)UHRF1過表達(dá)現(xiàn)象，但未就其對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后判斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。本研究采用組織微陣列聯(lián)合免疫組織化學(xué)技術(shù)（tissue microarrays and immunohistochemistry，TMAIHC）檢測(cè)結(jié)直腸癌患者癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中UHRF1蛋白的表達(dá)水平，并分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，探討UHRF1蛋白是否可作為結(jié)直腸癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，為結(jié)直腸癌患者治療方式的進(jìn)一步優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

收集201例結(jié)直腸癌手術(shù)切除的腫瘤組織及其配對(duì)手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織。全部病例于2006-2010年期間在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院收取，均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)為結(jié)/直腸腺癌，其中男性119例，女性82例；年齡14～91歲，中位年齡59歲；腫瘤T2、T3、T4期分別為16、118和67例；有和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分別為110和91例；腫瘤高、中、低分化分別為8、163和30例。其中有完整隨訪病例167例，中位生存時(shí)間為46.7個(gè)月（2.8～103.6個(gè)月）。所有患者術(shù)前均未接受放、化療等任何抗腫瘤治療。標(biāo)本取材后均進(jìn)行常規(guī)福爾馬林固定和石蠟包埋。

1.2 組織芯片制備

對(duì)組織標(biāo)本石蠟塊進(jìn)行切片、HE染色，顯微鏡下閱片，選取相應(yīng)的組織蠟塊并采點(diǎn)標(biāo)記。每個(gè)病例標(biāo)記3個(gè)典型的癌組織點(diǎn)和2個(gè)正常組織點(diǎn)，利用穿刺針管將標(biāo)記好的供體臘塊中的組織移入受體臘塊，制作成組織微陣列。每張組織微陣列切片厚度為4 μm。

1.3 免疫組化染色

石蠟組織芯片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min，0.1%枸櫞酸鈉緩沖液中微波加熱修復(fù)20 min；滴加一抗（鼠抗人UHRF1單抗，BD公司），并將片子置于濕盒內(nèi)4 ℃ 過夜；PBS浸洗后滴加二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒PV9000 （中杉金橋生物技術(shù)公司）中的試劑Ⅰ（增強(qiáng)劑）和試劑Ⅱ（ HRP標(biāo)記聚合物），在37 ℃孵箱中分別孵育20和30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片后鏡檢。

1.4 免疫組化評(píng)分

陽性信號(hào)定位于細(xì)胞核，不同病例蛋白表達(dá)差異主要在于陽性信號(hào)強(qiáng)度的不同。根據(jù)表達(dá)強(qiáng)度將評(píng)分分為4級(jí)：0分（不著色），1分（淺棕色），2分（棕黃色），3分（深棕色）。每例腫瘤及配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的組織點(diǎn)均分別進(jìn)行評(píng)分，取各自最高分為最終評(píng)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析UHRF1蛋白在腫瘤組織和手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織中的表達(dá)差異，采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)方法分析蛋白表達(dá)改變與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier方法分析UHRF1蛋白表達(dá)與患者術(shù)后總生存時(shí)間之間的關(guān)系，進(jìn)一步通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析不同臨床病理指標(biāo)和UHRF1蛋白表達(dá)水平對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間的影響。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化結(jié)果顯示，UHRF1蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色，在不同患者腫瘤組織中的表達(dá)水平差異較大（圖1）。UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)陽性率為54.2%（109/201），其中強(qiáng)表達(dá)、中度表達(dá)和弱表達(dá)的頻率分別為15.4%（31/201）、12.4%（25/ 201）和26.4%（53/201）；而在配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的上皮組織中陽性率僅為9.93%。UHRF1蛋白表達(dá)在腫瘤與正常組織之間具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.2 UHRF1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系

我們進(jìn)一步分析了UHRF1蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示UHRF1蛋白表達(dá)除了在近端結(jié)腸（回盲部、升結(jié)腸、結(jié)腸肝曲、橫結(jié)腸及結(jié)腸脾曲）、遠(yuǎn)端結(jié)腸（降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸）和直腸等不同部位的腫瘤組織中存在顯著性差異（P=0.008），遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌中的陽性率顯著高于近端結(jié)腸癌外，而UHRF1蛋白表達(dá)與其他臨床病理指標(biāo)均無顯著相關(guān)性（表1）。

2.3 UHRF1蛋白陽性表達(dá)與患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系及其獨(dú)立預(yù)后判斷價(jià)值

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，UHRF1蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間顯著相關(guān)，該蛋白表達(dá)陽性患者的術(shù)后生存時(shí)間顯著短于表達(dá)陰性患者的術(shù)后生存時(shí)間（P=0.023）（圖2）。Cox回歸分析表明，UHRF1蛋白表達(dá)（P=0.008）、分化程度（P=0.011）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）為結(jié)直腸癌患者術(shù)后的獨(dú)立預(yù)后因素（表2）。

3 討 論

多項(xiàng)研究顯示UHRF1在人類多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)［4-11］，參與細(xì)胞增殖［12-14］、凋亡［15-16］、細(xì)胞周期調(diào)控［17］等重要的生物學(xué)過程，并與腫瘤放化療敏感性相關(guān)［15，18-19］。Jenkins等［14］發(fā)現(xiàn)UHRF1的鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)維持泛素連接酶的活性至關(guān)重要，敲降UHRF1對(duì)人肺癌細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，Daskalos等［4］有類似報(bào)道；而Hopfner等［20］研究顯示在人肺成纖維細(xì)胞中過表達(dá)UHRF1后接觸抑制現(xiàn)象被削弱。Li等［15］將UHRF1正義轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)UHRF1過表達(dá)可同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞自發(fā)凋亡和輻射所引起的細(xì)胞凋亡，Abbady等［16］的研究結(jié)果也支持這一現(xiàn)象。Jeanblanc等［17］研究認(rèn)為UHRF1通過與甲基化RB1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，參與細(xì)胞周期調(diào)控。UHRF家族所特有的SRA結(jié)構(gòu)域與半甲基化的GG位點(diǎn)有很高的親和性，使DNA在復(fù)制過程中維持甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致RASSF1［4］、CDKN2A［4，13］和BRCA1［6］等抑癌基因永久沉默。此外，Li［15］、Un［18］和Muto［19］的研究表明，UHRF1的高表達(dá)在腫瘤放化療敏感性中具有重要作用，有可能作為腫瘤放化療增敏的新靶點(diǎn)。

在我們的研究中，UHRF1在結(jié)直腸癌及其配對(duì)正常組織中的陽性表達(dá)率分別為54.2%和9.93%，前者顯著高于后者（P＜0.01）。Kofunato等［12］的研究表明結(jié)直腸癌中UHRF1表達(dá)率為65.8%（152/231），而在正常結(jié)直腸上皮中則未見UHRF1的表達(dá)。由于結(jié)直腸手術(shù)切端正常組織在包埋和切片過程中可能出現(xiàn)橫縱切面的差別，導(dǎo)致一些切片中基底層上皮細(xì)胞很少。因此我們推測(cè)，上述結(jié)直腸正常腺上皮中的表達(dá)差異可能是由于縱橫切面差異造成的，當(dāng)然也不排除這種差異可能與二者陽性標(biāo)準(zhǔn)及樣本取材位置有關(guān)。值得關(guān)注的是，我們還發(fā)現(xiàn)UHRF1的陽性表達(dá)與腫瘤位置有關(guān)，總體看來遠(yuǎn)端結(jié)直腸癌的陽性率顯著高于近端結(jié)腸癌組織。另一方面，與之前在肺癌［5］、膀胱癌［7］、喉鱗癌［11］等研究相一致，UHRF1的表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P=0.023），而且是一種結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的獨(dú)立預(yù)后因子（P=0.008）。

綜上所述，UHRF1的陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差顯著相關(guān)。檢測(cè)UHRF1蛋白的表達(dá)水平變化可能有助于對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行預(yù)后評(píng)估，然而其在結(jié)直腸癌發(fā)生進(jìn)展過程中的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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Expression and prognostic
value of UHRF1in colorectal cancer

WU Lifei1， HAO Jiajie2，ZHANG Tongtong2，LIANG Jianwei3，WANG Zheng3，ZHANG Yu2，XU Xin2，CAI Yan2，WANG Mingrong2，*，LI Min1，*
（1. Department of Gastroenterology， Anqing City Hospital， Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University， Anqing 246003，Anhui； 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology，Cancer Institute/Hospital， Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021；3. Department of Abdominal Surgery， Cancer Institute/Hospital，Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences， Beijing 100021， China）

目的：探討泛素樣含PHD和環(huán)指域1（UHRF1）蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其預(yù)后判斷價(jià)值。方法：采用組織微陣列聯(lián)合免疫組織化學(xué)（TMA-IHC）技術(shù)檢測(cè)201例結(jié)直腸癌中UHRF1蛋白的表達(dá)情況，分析其與臨床病理指標(biāo)及術(shù)后生存時(shí)間之間的相關(guān)性。結(jié)果：UHRF1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽性率為54.2%（109/201），顯著高于配對(duì)的手術(shù)切端形態(tài)學(xué)正常的組織（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析顯示，UHRF1蛋白表達(dá)陽性患者術(shù)后生存時(shí)間短于表達(dá)陰性的患者（P=0.023）。Cox回歸分析結(jié)果表明，UHRF1蛋白是結(jié)直腸癌患者根治術(shù)后的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.008）。結(jié)論：UHRF1蛋白可能作為結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后判斷的分子標(biāo)志。

UHRF1；結(jié)直腸癌；分子標(biāo)志；預(yù)后判斷

OBJECTIVE:This study aimed to evaluate the expression and prognostic significance of ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1 （UHRF1） protein in colorectal cancer （CRC）.METHODS：The expression of UHRF1 in 201 CRC cases and adjacent normal tissues were detected by tissue microarrays and immunohistochemistry（TMA-IHC），then the relationship between UHRF1 protein expression and clinio-pathological parameters as well as its prognostic value were examined by statistical analysis.RESULTS：Positive expression of UHRF1 was observed in 54.2%（109/201） of CRC tissues，and the frequency in CRC was significantly higher than that in adjacent nomal tissues （P＜0.01）. Kaplan-Meier survival curves showed that CRC patients with negative expression of UHRF1 had shorter overall survival time （P=0.023）. Cox regression analysis indicated that UHRF1 protein expression was an independent prognostic factor（P=0.008）.CONCLUSION：UHRF1 might be a biomarker f or prognostic evaluation of CRC patients.

UHRF1；colorectal cancer；molecular marker；prognostic evaluation

R735.3

A

1004-616X（2015）01-0030-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.007

2014-11-17；

2014-12-30

公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201402003）

作者信息：吳李飛，E-mail：wulifei0556@yeah.net。*通信作者，王明榮，E-mail：wangmr2015@126.com；李 敏，E-mail：lmin0556@163.com