崔寶弟，王敏，孫震曉*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京100102）

去甲斑蝥素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用

崔寶弟，王敏#，孫震曉*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生物制藥系，北京100102）

肺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤，其總體發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)，已成為各種腫瘤死亡的首要原因，嚴(yán)重威脅人類健康。肺癌也已成為我國(guó)近十幾年來發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)速度最快的腫瘤［1］。

2010版藥典記載斑蝥有破血逐瘀，散結(jié)消癥，攻毒蝕瘡的功能［2］。斑蝥在我國(guó)己有兩千余年的用藥歷史，現(xiàn)代研究表明它具有明顯的抗腫瘤作用［3］。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是斑蝥中抗腫瘤活性成分斑蝥素的去甲基衍生物，與斑蝥素相比，毒性更小，臨床上用于肝癌的治療，對(duì)肺癌、乳腺癌和白血病細(xì)胞也有較強(qiáng)的抑制作用［4-5］。去甲斑蝥素具有一定升高外周血白細(xì)胞的作用，與多數(shù)抗癌藥物具骨髓抑制的不良反應(yīng)相比，具有一定的優(yōu)勢(shì)［6］。因此，本文研究去甲斑蝥素對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肺腺癌A549細(xì)胞購(gòu)于北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑與藥品 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；NCTD購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、四甲基噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium b romide，MTT）、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）等購(gòu)自Ameresco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、 無水乙醇、95%乙醇、濃鹽酸、甘油、NaOH等均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，均為市售分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含l0% （V/V）胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS），100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液傳代。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用細(xì)胞血球計(jì)數(shù)板法：取稀釋混勻的細(xì)胞懸液10 μL，輕輕打入放置蓋片的血球計(jì)數(shù)板中，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 MTT法檢測(cè)NCTD對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔1 000個(gè)的密度接種于96孔板，培養(yǎng) 24 h后換含 15、30、40、60、80和120 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基。24、48和72 h后加入終濃度為0.5mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清，每孔加入150 μL DMSO，在微量振蕩器上振蕩5～10min，酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)得吸光度值。每次試驗(yàn)取3個(gè)平行孔，重復(fù)3次。以NCTD濃度為橫坐標(biāo)，以存活率為縱坐標(biāo)繪制存活曲線，并按下式計(jì)算存活率。

1.2.4 細(xì)胞恢復(fù)試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2 000個(gè)的密度接種于96孔板，24 h后換含 30、60、120、240和480 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基，并測(cè)加藥0h的吸光度值D（550）。加藥作用24 h后，換未加藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，并測(cè)恢復(fù)0 h的吸光度值D（550）。后每隔24 h測(cè)定吸光度值，連續(xù)測(cè)定5 d。以天數(shù)為橫坐標(biāo)，以存活率為縱坐標(biāo)繪制存活率曲線。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 以每孔1.2×105個(gè)的密度取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，24 h后加入含40、50、60 μmol/L NCTD的培養(yǎng)基處理0～72 h，在0、24、48、72 h時(shí)用倒置相差顯微鏡觀察NCTD作用狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期與凋亡 以每皿2×106個(gè)的密度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于直徑10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，接種30 h后換含40、50、60μmol/L NCTD的培養(yǎng)基，并收集0 h細(xì)胞，后每隔24 h收集24、48和72 h細(xì)胞，4 ℃保存過夜。1 000 r/min 離心5 min棄上清。500 μL PBS重懸，加入RNaseA至終濃度20 μg/mL， 37 ℃水浴45 min。再加入PI染液至終濃度50μg/mL，4 ℃避光染60 min。最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，上機(jī)前常規(guī)進(jìn)行光路流路校準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 NCTD對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

NCTD對(duì)肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)活力的影響如圖1，與對(duì)照組相比，在30～240 μmol/L范圍內(nèi) （ 除30μmol/L的24 h組外），NCTD使A549 細(xì)胞活力均明顯下降（P均＜ 0.05或P＜0.01），并且隨著劑量和時(shí)間增加，細(xì)胞活力逐漸下降。

2.2 恢復(fù)培養(yǎng)5 d細(xì)胞的存活率

如圖2，在30～240 μmol/L濃度范圍內(nèi)，NCTD對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用在藥物撤除24 h后逐漸消失，并且在NCTD各個(gè)濃度作用下，細(xì)胞在隨后的幾天里有不同程度的恢復(fù)。 30～60 μmol/L NCTD作用24h后，A549細(xì)胞的活力在恢復(fù)培養(yǎng)的第5天完全恢復(fù)，與對(duì)照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 NCTD作用后A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

40、50 和60 μmol/L NCTD作用A549細(xì)胞0～72 h，細(xì)胞形態(tài)變化結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，A549細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，隨著作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞變圓浮起增多。

2.4 細(xì)胞周期分析

NCTD作用A549細(xì)胞0 h的細(xì)胞周期分布為：G0～G1期69.9%、S期21.4%、G2～M期9.4%，凋亡率為0.12%。NCTD作用A549細(xì)胞24～72 h的細(xì)胞周期如表1～ 3及圖4所示。不同濃度NCTD作用0～72 h，對(duì)A549細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的G2～M期阻滯，與對(duì)照組相比，各濃度NCTD處理組未見明顯細(xì)胞凋亡發(fā)生。

3 討 論

去甲斑蝥素為斑蝥素的結(jié)構(gòu)同類物，臨床上具有較強(qiáng)抗腫瘤活性并有升高外周血白細(xì)胞的作用。臨床用于肝癌、食管癌、胃及賁門癌等以及白細(xì)胞低下癥，亦可作為術(shù)前用藥或用于聯(lián)合化療，與其他化療藥物聯(lián)用能提高療效、減少副作用。近年來主要用于消化道腫瘤和肺癌的治療。但是NCTD對(duì)肺癌的抑制作用及抗癌機(jī)制尚不明確。

本研究表明，NCTD在一定濃度下對(duì)肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，并且這種生長(zhǎng)抑制作用在NCTD撤除后逐漸消失。NCTD在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的過程中伴隨著細(xì)胞變圓浮起，通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，NCTD主要通過G2～M期阻滯影響A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。

有研究表明，NCTD可以通過損傷腫瘤細(xì)胞DNA，影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，從而阻止腫瘤細(xì)胞周期，抑制其增殖，例如降低胰腺癌細(xì)胞內(nèi)CDK1的表達(dá)，使其停滯于G2～M期［7］；下調(diào)宮頸癌細(xì)胞中Cyclins B和Cdc2的表達(dá)，使其停滯于G2/M期［8］，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，NCTD主要通過誘導(dǎo)人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。干擾細(xì)胞有絲分裂過程中微管的組裝和紡錘體的形成可能是NCTD誘導(dǎo)SK-OV-3細(xì)胞M期阻滯的原因之一，而NCTD誘導(dǎo)的SK-OV-3細(xì)胞發(fā)生凋亡可不依賴細(xì)胞M期阻滯［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)，NCTD可以通過破壞膽管癌RBE細(xì)胞Tubulin骨架、抑制α-Tubulin mRNA的表達(dá)，阻止紡錘體的形成，將細(xì)胞周期阻滯在G2～M期，導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制［10］，我們前期的研究也表明，NCTD 可以在體外抑制微管蛋白的聚合，并在SK-OV-3細(xì)胞中得到驗(yàn)證［11］。近年來，科學(xué)家新提出一種細(xì)胞死亡概念，稱為有絲分裂災(zāi)變死亡（mitotic catastrophe， MC），用來描述由于細(xì)胞有絲分裂異?；蚣?xì)胞長(zhǎng)時(shí)間阻滯在有絲分裂期而誘發(fā)的一種細(xì)胞死亡方式，可以在離子輻射、化療藥物或高溫作用下發(fā)生［12］。NCTD誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2～M期阻滯是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂災(zāi)變死亡，尚需要進(jìn)一步研究。

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The inhibition of norcantharidin on human lung adenocarcinoma A549 cells

CUI Baodi，WANG Min#，SUN Zhenxiao*
（Department of Biopharmaceutical， School of Chinese Pharmacology，Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

目的： 研究去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并初步探討其作用機(jī)制。方法：采用四甲基噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn)檢測(cè)0～240 μmol/L NCTD在0～72 h內(nèi)對(duì)A549細(xì)胞活力的影響；NCTD處理A549細(xì)胞24 h后換正常培養(yǎng)基，用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞恢復(fù)與增殖的情況；采用倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞經(jīng)40、50和60 μmol/L NCTD處理0～72 h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)40～60 μmol/L NCTD對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果：30～240 μmol/L NCTD對(duì)A549細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用（P＜0.05）；在30～120 μmol/L濃度范圍內(nèi)，NCTD對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用在NCTD撤除24 h后逐漸消失，30～60 μmol/L NCTD作用A549細(xì)胞24 h后，A549細(xì)胞的活力在恢復(fù)培養(yǎng)的第5天完全恢復(fù)；40、50和60 μmol/L NCTD作用A549細(xì)胞0～72 h，細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的G2～M期阻滯，與對(duì)照組相比，NCTD誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡作用不明顯（P＞0.05）。結(jié)論：40～60 μmol/L NCTD主要通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞G2～M期阻滯而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

去甲斑蝥素；肺癌；A549細(xì)胞；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

OBJECTIVE:To study the effects of norcantharidin （NCTD） on human lung cancer cells，and investigate the mechanisms.METHODS：The growth inhibition of A549 cells treated with 0-240μmol/L NCTD for 0-72hours was analyzed by MTT assay. The recovery growth and proliferation of A549 cells treated with 0-120 μmol/L NCTD for 24 h was evaluated by MTT assay. The morphological changes of A549 cells treated with 40，50 and 60 μmol/L NCTD for 0-72 h were examined under inverted microscope. The apoptosis and cell cycle changes of A549 cells treated with 40-60μmol/L NCTD were detected by flow cytometry.RESULTS：NCTD inhibited the growth of A549 cells in 30-240μmol/L（P＜0.05）. Cell growth inhibition could hardly be detected 24 h after 30-240 μmol/L NCTD was removed from culture medium. The vitality of A549 cells was fully recovered in 5 d after 30-60 μmol/L NCTD was removed from culture medium. A549 cells showed G2-M phase block but no obvious apoptosis compared with the control group when treated with 40，50 and 60 μmol/L NCTD for 0-72 h.CONCLUSION：NCTD （40-60 μmol/L） inhibited human lung cancer A549 cell growth mainly by cell G2-M phase block.

norcantharidin；lung cancer；A549 cell；cell cycle ； apoptosis

R734.2

A

1004-616X（2014）01-0021-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2014.01.005

2014-06-22；

2014-09-23

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題項(xiàng)目（2014JYBZZ-XS097）；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題項(xiàng)目（2013JYBzz-XS088）作者信息： 崔寶弟，E-mail：cbdbaodi@sina.com。#該作者對(duì)本文的貢獻(xiàn)與

等同。*通信作者，孫震曉，Tel：010-84738646； Email：sunzxcn@hotmail.com