李妙，馬璐，柏青，陳雯，陳麗萍*

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510080）

PP2A B56α亞基介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)的
細(xì)胞毒性

李妙，馬璐，柏青，陳雯，陳麗萍*

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州510080）

鎘及其化合物是環(huán)境中常見的重金屬污染物，長期的鎘暴露與多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1］。研究表明在鎘誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中，鎘可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡、DNA損傷、DNA損傷修復(fù)能力下降以及基因組不穩(wěn)定［2］。然而，其毒作用的分子機(jī)制至今仍未闡明。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是真核生物中最主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族，調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞生命事件［3-6］。PP2A全酶由核心酶（支架A亞基和催化C亞基組成）與不同的調(diào)節(jié)B亞基組成，形成至少75種不同組合的PP2A全酶［7］。因此，B亞基的多樣性決定了PP2A功能的多樣性，特定的PP2A全酶參與特定的信號(hào)通路。在我們前期的研究中，發(fā)現(xiàn)PP2A全酶的活性與鎘誘導(dǎo)的毒性效應(yīng)密切相關(guān)［8］，然而，PP2A通過哪些信號(hào)通路來調(diào)控鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性有待闡明。本實(shí)驗(yàn)室前期利用PP2A亞基缺失細(xì)胞模型篩查影響鎘誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的PP2A亞基，發(fā)現(xiàn)特異的PP2A亞基如PR110、B56δ 表達(dá)抑制后增加鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［9-10］，與此相反，B56α亞基的表達(dá)缺失導(dǎo)致細(xì)胞對鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性抵抗。為了闡述B56α在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用，本研究在人胚腎上皮細(xì)胞HEK構(gòu)建了PP2A B56α表達(dá)降低的細(xì)胞模型，并用氯化鎘染毒，觀察PP2A B56α低表達(dá)對鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性及相關(guān)信號(hào)通路的影響，探討B(tài)56α調(diào)控鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和質(zhì)粒

MEMα基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco公司）；Cell Proliferation Kit （WST-1）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）抑制劑SP600125（上海碧云天公司）；氯化鎘（CdCl2，購自美國Sigma公司）；anti-B56α抗體（Novus，美國），抗金屬硫蛋白（metallothionein， MT）抗體（Genetex，美國），p-JNK抗體（Thr183/Tyr185） （CST，美國）。慢病毒質(zhì)粒pLKO.1-puro-SHB56α-1和pLKO.1-puro-SHB56α-2（靶向PPP2R5A的不同序列）由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Hahn教授贈(zèng)送。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

永生化人胚腎上皮細(xì)胞HEK由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Hahn教授贈(zèng)送，在含有10%胎牛血清的MEMα培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PP2A B56α缺陷細(xì)胞株的構(gòu)建 pLKO.1-puro-SHB56α和包裝質(zhì)粒VSVG、△8.9通過磷酸鈣法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，獲得含有目的基因的病毒顆粒。病毒顆粒通過0.45 μm濾器過濾后感染HEK細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，免疫印跡驗(yàn)證，獲得B56α缺陷細(xì)胞株HEKSHB56α-1和HEK-SHB56α-2。同步轉(zhuǎn)染pLKO.1-puro-SHGFP獲得對照細(xì)胞HEK-SHGFP。

1.3.2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分別收集細(xì)胞，消化后按每孔6×103個(gè)細(xì)胞用排槍接種到96孔板，貼壁培養(yǎng)24 h。按濃度0、10、20、40、80 μmol/L配制CdCl2染毒液。將細(xì)胞培養(yǎng)基吸走，每孔加入100 μL染毒液繼續(xù)培養(yǎng)24h。傾斜培養(yǎng)板，小心吸棄染毒液，再加入含10 μL WST-1溶液的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1.5h，置搖床上混勻5 min，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定各孔吸光度值。以細(xì)胞相對活力評估細(xì)胞毒性大小，其計(jì)算公式為：

細(xì)胞相對活力=［處理組D（570）值-空白孔D（570）值］/［對照組D（570）值-空白孔D（570）值］×100%

1.3.3 免疫印跡檢測B56α和MT的表達(dá)以及JNK的磷酸化水平 細(xì)胞消化后按每皿5×105個(gè)接種，貼壁培養(yǎng)24 h，用終濃度為0、10、20、40、80 μmol/L的CdCl2染毒24 h，或用40 μmol/L的CdCl2染毒不同時(shí)間（在0、2、6、12、24 h收集）。另設(shè)SP600125與CdCl2同時(shí)處理組：相應(yīng)濃度的CdCl2染毒液加終濃度為10μmol/L的SP600125溶液。細(xì)胞收集后直接用2×SDS上樣緩沖液裂解以獲得總蛋白，并使用細(xì)胞破碎儀（30%，超聲5 s，停頓1 s）處理樣品，6%～12%梯度膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，然后分別加入抗B56α（1∶2 000）、p-JNK （Thr183/Tyr185）（1∶1 000） 以及MT（1∶800）的抗體4℃ 孵育過夜，次日用PBS/T洗3次，每次5 min，再加入山羊抗兔或抗鼠IgG-HRP （1∶10 000），室溫孵育1 h。加上ECL發(fā)光劑進(jìn)入暗室使用X光膠片曝光成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 PP2A B 56α表達(dá)抑制對CdCl2誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的影響

在調(diào)控鎘誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的PP2A亞基的初步篩查中發(fā)現(xiàn)B56α缺失降低鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，將靶向B56α的兩個(gè)有效干擾片段（排除靶外效應(yīng)）導(dǎo)入HEK細(xì)胞，構(gòu)建B56α表達(dá)降低的穩(wěn)定細(xì)胞株。圖1A和B顯示，HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2細(xì)胞中B56α 的表達(dá)分別為對照細(xì)胞HEK-SHGFP的21%和28% （P＜ 0.05），表明PP2A B56α表達(dá)降低的細(xì)胞株構(gòu)建成功。用不同劑量的CdCl2染毒細(xì)胞株24 h，圖1C顯示隨著CdCl2染毒劑量的增加，細(xì)胞相對活力逐漸下降。和對照細(xì)胞相比，PP2A B56α表達(dá)降低的細(xì)胞株的相對活力升高了10%～32% （P＜0.05），提示B56α表達(dá)降低導(dǎo)致鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性降低。以上結(jié)果表明B56α在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起作用。

2.2 CdCl2對JNK磷酸化的誘導(dǎo)作用

用不同劑量（0、10、20、40、80 μmol/L）的CdCl2處理HEK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)JNK（Thr183/Tyr185）的磷酸化水平（p-JNK）和MT表達(dá)水平隨CdCl2的劑量增加而增加（P＜ 0.05）（圖2A）。當(dāng)用40 μmol/L CdCl2處理HEK細(xì)胞不同時(shí)間（0、2、6、12、24 h）后，與處理0 h組相比，觀察到p-JNK和MT的表達(dá)水平隨時(shí)間增加逐漸增加（P＜ 0.05），在12 h達(dá)到峰值（圖2B）。這些結(jié)果提示JNK的磷酸化可能與MT的誘導(dǎo)表達(dá)相關(guān)。

2.3 JNK磷酸化增加促進(jìn)MT的表達(dá)并降低鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性

為了進(jìn)一步證實(shí)MT的表達(dá)受JNK的磷酸化調(diào)控，分別用20 μmol/L和40 μmol/L CdCl2處理HEK細(xì)胞12h，p-JNK和MT的表達(dá)水平顯著增加（圖3A和B）。然而，當(dāng)聯(lián)合JNK抑制劑SP600125（10 μmol/L）作用時(shí)，p-JNK水平則下降35%～38%（P＜0.05），MT的表達(dá)也下降了13%～35%（P＜0.05），表明抑制JNK的磷酸化激活導(dǎo)致MT的表達(dá)下降。同時(shí)觀察到在JNK抑制劑SP600125和CdCl2同時(shí)作用下，HEK細(xì)胞的細(xì)胞相對活力降低6%～ 20% （P＜0.05） （圖3C）。以上這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)JNK磷酸化激活影響MT的表達(dá)，且JNK磷酸化和MT的表達(dá)增加可以抵抗CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

2.4 抑制PP2A B56α表達(dá)對JNK磷酸化水平的影響

為了證實(shí)PP2A B56α可能通過調(diào)控JNK的磷酸化來調(diào)控MT表達(dá)的推測，用40 μmol/L CdCl2處理B56α表達(dá)降低的細(xì)胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2，觀察B56α表達(dá)降低對CdCl2誘導(dǎo)JNK磷酸化水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HEK-SHGFP細(xì)胞相比，上述2株細(xì)胞中的JNK的磷酸化水平分別增加了2.78倍和1.26倍（P＜0.05），同時(shí)MT的表達(dá)也分別增加了1.36倍和1.19倍（P＜0.05）（圖4A），提示JNK磷酸化水平受PP2A B56α調(diào)控。此外，還發(fā)現(xiàn)用40 μmol/L CdCl2作用HEK細(xì)胞不同時(shí)間（0、2、6、12、24 h），和處理0 h組相比，B56α的表達(dá)水平呈下降趨勢（P＜0.05），JNK的磷酸化則顯著增加（P＜0.05），MT的表達(dá)也呈升高的趨勢（P＜0.05）（圖4B），提示在重金屬應(yīng)激下，B56α降低有利于激活JNK 調(diào)控MT表達(dá)的相關(guān)通路。以上結(jié)果進(jìn)一步說明PP2A B56α可能通過調(diào)控JNK的磷酸化水平來影響MT的表達(dá)，進(jìn)而影響CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。

3 討 論

鎘的長期暴露與DNA損傷、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等多種分子事件相關(guān)［2］。近年來，PP2A相關(guān)信號(hào)通路在環(huán)境化學(xué)物毒性通路中的作用受到廣泛的關(guān)注［4，6，9，11］。PP2A各亞基的突變?nèi)笔б约氨磉_(dá)異常會(huì)導(dǎo)致PP2A功能失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)PP2A B56α在鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起著重要的作用，并揭示了B56α通過介導(dǎo)JNK的去磷酸化來影響MT的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的關(guān)鍵分子事件。

金屬硫蛋白（MT）是一類含半胱氨酸的小分子的金屬結(jié)合蛋白。它屬于應(yīng)激蛋白，在重金屬或氧化應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)升高［12-13］，能夠維持鋅銅穩(wěn)態(tài)、解除重金屬毒性、清除氧自由基等［14-16］。MT的表達(dá)升高可被認(rèn)為是環(huán)境重金屬暴露毒性效應(yīng)的保護(hù)機(jī)制［12］。因此，闡明MT的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，有助于找到重金屬毒作用的關(guān)鍵信號(hào)通路，為重金屬污染物的防治提供靶點(diǎn)。

金屬調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子-1（metal-regulatory transcription factor-1，MTF-1）是調(diào)控MT基因表達(dá)的關(guān)鍵因子［17］。研究表明MTF-1的活性受磷酸化調(diào)控，且由蛋白激酶PKC、 JNK、MKK4等介導(dǎo)［18］，其中JNK的磷酸化激活能進(jìn)一步使MTF-1發(fā)生磷酸化，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄活性［18］。相一致的是，我們也觀察到CdCl2作用下JNK的磷酸化水平增加進(jìn)而上調(diào)MT的表達(dá)。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kidnase，MAPK）超家族成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。JNK信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡中起著重要的作用［19-20］。JNK信號(hào)通路可通過磷酸化促凋亡或抗凋亡相關(guān)蛋白而表現(xiàn)促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的兩面性［21-23］。而本研究發(fā)現(xiàn)JNK活性受抑制后導(dǎo)致CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性增加，可能原因是其抑制MTF-1的活性進(jìn)而影響MT的誘導(dǎo)表達(dá)，這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)JNK在細(xì)胞對重金屬應(yīng)激中起著重要作用。

特異PP2A全酶可以通過調(diào)控特定的信號(hào)通路來影響重金屬誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，我們以往的研究發(fā)現(xiàn)PP2A PR110通過去磷酸化作用激活MTF-1調(diào)控MT表達(dá)［9］，而PP2A B56δ抑制后增加鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［9-10］。以往研究表明JNK的磷酸化受到蛋白磷酸酶的調(diào)控［24］。本研究則發(fā)現(xiàn)B56α通過調(diào)控JNK磷酸化來影響MT表達(dá)，表明B56α是CdCl2應(yīng)激時(shí)決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵分子。相一致的是，在心肌細(xì)胞JNK的持續(xù)激活通過上調(diào)AUF1使PP2A B56α表達(dá)降低［25］，表明JNK的磷酸化激活與PP2A B56α密切相關(guān)。然而，PP2A B56α是否直接調(diào)控JNK去磷酸化有待進(jìn)一步闡明。

綜上，本研究揭示了PP2A B56α參與鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的作用及分子機(jī)制。期望這些關(guān)鍵分子能為鎘暴露的毒性機(jī)制更深入的闡明提供線索和依據(jù)，為環(huán)境化學(xué)物毒性通路的預(yù)測提供理論依據(jù)。

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Role of PP2A B56 α subunit in cadmium-induced cytotoxicity

LI Miao，MA Lu，BAI Qing，CHEN Wen，CHEN Liping*（Faculty of Preventive Medicine， School of Public Health，
Sun-Yat Sen University， Guangzhou 510080， Guangdong， China）

目的：探 討蛋白磷酸酶2A（PP2A）B56α亞基在調(diào)控CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用及其機(jī)制。方法：利用病毒感染法在人胚腎上皮細(xì)胞HEK上構(gòu)建PP2A B56α表達(dá)降低的細(xì)胞株模型（HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2），采用改良四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。用不同濃度（0、10、20、40和80μ mol/L）CdCl2聯(lián)合或不聯(lián)合c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制劑SP600125染毒細(xì)胞不同時(shí)間（0、2、6、12和24 h），采用免疫印跡檢測B56α亞基、金屬硫蛋白（MT）的表達(dá)和JNK的磷酸化水平。結(jié)果：免疫印跡結(jié)果證實(shí)細(xì)胞株HEK-SHB56α-1和HEK-SHB56α-2構(gòu)建成功。與對照組比較，PP2A B56α表達(dá)抑制導(dǎo)致鎘誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性減小，JNK的磷酸化水平和MT的表達(dá)水平均顯著增加。用不同劑量CdCl2處理細(xì)胞株12h ，發(fā)現(xiàn)B56α表達(dá)抑制導(dǎo)致JNK磷酸化（p-JNK）分別增加了2.78和1.26倍（P＜0.05），MT的表達(dá)也分別增加了1.36和1.19倍（P＜0.05）。用p-JNK抑制劑SP600125作用時(shí)，p-JNK的表達(dá)降低了35%～38%（P＜0.05），MT的表達(dá)下降了13%～35%（P＜0.05）， CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性顯著增加（P＜0.05）。此外，用CdCl2處理細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)，B56α的表達(dá)逐漸降低（P＜0.05），而p-JNK和MT的表達(dá)水平呈逐漸增加趨勢（P＜0.05）。結(jié)論：PP2A B 56α在調(diào)控CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起著重要作用，其作用機(jī)制可能通過介導(dǎo)JNK的去磷酸化調(diào)控MT的表達(dá)而發(fā)揮作用。本研究揭示了PP2A參與重金屬應(yīng)激的關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路的調(diào)控。

氯化鎘；細(xì)胞毒性；蛋白磷酸酶2A；p-JNK；金屬硫蛋白

OBJECTIVE:To identify involvement of protein phosphatase 2A B56α in the regulation of cytotoxicity induced by cadmium chloride （CdCl2） and address the underlying molecular mechanism.METHODS：Stable cell lines were generated by infecting HEK cells with lentiviral shRNA targeting B56α subunit. Modified MTT was performed to detect the cytotoxicity induced by CdCl2. Immunoblotting analysis was applied to examine the expressions of B56α，p-JNK and MT in cells treated with different concentrations of CdCl2or co-treated with SP600125.RESULTS：Immunoblotting results verified that stable cell lines HEK-SHB56α-1 and HEK-SHB56α-2 were successfully established. We found that suppression of PP2A B56α reduced the cytotoxicity induced by CdCl2. In addition，the phosphorylation status of c-Jun N-terminal kinases （JNK） and the expression level of MT were significantly increased in response to CdCl2. Suppression of B56α led to a 2.78 or 1.26-fold（P＜0.05） increase of p-JNK in cells treated with CdCl2for 12 h，and a 1.36 or 1.19-fold （P＜0.05） increase of MT. Upon SP600125 treatment，the expression level of p-JNK and MT were reduced by 35%-38% （P＜0.05） and 13%-35%（P＜0.05），respectively，while cytotoxicity induced by CdCl2was enhanced（P＜0.05）. More-over，the expression of B56α was lowered（P＜0.05），but p-JNK and MT were increased（P＜0.05）in a time-dependent manner upon CdCl2treatment.CONCLUSION：PP2A B56α regulated MT expression via dephosphorylating JNK，and affecting the cytotoxicity induced by CdCl2. Our study demonstrated that PP2A B56α participated in regulating the targets and pathways in response to metallic stress.

CdCl2；cytotoxicity；protein phosphatase 2A；p-JNK；metallothionein

R994.6

A

1004-616X（2015）01-0011-06

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.003

2014-09-25；

2014-12-03

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31401213）

作者信息： 李妙，E-mail：michellelee3828@hotmail.com。*通信作者，陳麗萍，E-mail：chenliping_happy06@163.com