高 敏，夏 青，劉 永綜述

全基因組關(guān)聯(lián)研究在冠心病中的研究進展

高 敏1，夏 青2，劉 永3綜述

摘要目前認為冠心病（CAD）是一種由多因素交互作用的慢性復(fù)雜性疾病，是危害人類健康的重大疾病之一，對CAD遺傳機制的研究一直備受關(guān)注。近些年，全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）的引入使CAD易感基因的研究更加快速、可靠，世界各地的醫(yī)學研究者應(yīng)用此研究策略已成功發(fā)現(xiàn)了多個CAD遺傳易感基因或易感位點?，F(xiàn)就近些年GWAS的進展、面臨的挑戰(zhàn)及其發(fā)展趨勢進行闡述。

關(guān)鍵詞全基因組關(guān)聯(lián)研究；冠心?。贿z傳易感位點；亞洲；漢族人群

2015－01－04接收

2安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，合肥 230032

3安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院09級婦幼衛(wèi)生專業(yè)，合肥230032

全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）是一種高通量基因分型技術(shù)［1］。目前，GWAS已成功地在許多復(fù)雜性疾病中尋找到相關(guān)遺傳易感基因或變異位點，例如阿爾茲海默癥、腫瘤及類風濕性關(guān)節(jié)炎等［2－3］，為這些疾病的診斷、藥物設(shè)計及個性化防治提供了堅實的理論基礎(chǔ)。冠心病（coronary artery disease，CAD）是一種由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的慢性復(fù)雜性疾病，是世界范圍內(nèi)人類健康的頭號殺手。據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，2030年世界缺血性心臟病的死亡人數(shù)將占總死亡人數(shù)的13．1%［4］，CAD的防治刻不容緩。GWAS的引入為CAD相關(guān)易感基因的搜尋提供了新的機遇，此研究策略突破傳統(tǒng)的候選基因連鎖分析的一些不足，成功地發(fā)現(xiàn)了多個CAD相關(guān)易感區(qū)域?，F(xiàn)就近些年CAD GWAS的研究進展進行如下報道。

1 CAD的GWAS

GWAS是一種通過高通量基因分型技術(shù)測定成千上萬個單核苷酸多態(tài)，結(jié)合臨床表型確定疾病相關(guān)易感基因或易感位點，從而探索復(fù)雜性疾病遺傳機制的方法［1］。與在已知基因內(nèi)尋找疾病易感位點的候選基因連鎖研究相比，GWAS具有樣本量大、重復(fù)性好、可多中心研究等優(yōu)點；其在研究方法上主要分為3種：單階段研究、兩階段研究及多階段研究。兩階段研究和多階段研究應(yīng)用的最多，即先通過測定小樣本量的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），從中找出陽性的SNPs，后期階段再針對這些陽性SNPs進行重復(fù)驗證。

第一個有實際意義的CAD GWAS是日本科學家Ozaki et al［5］在Nature genetics上發(fā)表的關(guān)于淋巴細胞毒素-α基因（lymphotoxin-α gene，LTA）功能位點與心肌梗死的關(guān)聯(lián)研究。此研究對94例心肌梗死病例和658例對照的92 788個SNPs位點進行高通量基因分型，然后在1 133例心肌梗死病例和1 006例對照人群中進行重復(fù)驗證。結(jié)果顯示，LTA基因中有2個SNPs位點與心肌梗死相關(guān)聯(lián)（P＜1 ×10－6）。目前，運用GWAS方法找到的CAD相關(guān)基因位點已達30多個，陽性結(jié)果在世界部分種族中得到重復(fù)驗證。

2 CAD的GWAS最新國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

2．1 國外現(xiàn)狀 CAD GWAS起先主要在歐美等發(fā)達國家取得進展，發(fā)現(xiàn)了許多有重要價值的CAD相關(guān)易感基因和變異，例如9p21、1q41、12q24、6q25等區(qū)域，這些結(jié)果已在世界部分種族人群中得到了驗證。近些年在此基礎(chǔ)上，相關(guān)的研究進一步深入且新的研究又不斷涌現(xiàn)。

2．1．1 歐洲 2007年，一項大型的GWAS WTCCC［6］在英國人群中展開，研究首次顯示9p21區(qū)域rs1333049與高加索人群CAD顯著關(guān)聯(lián)（P＜1× 10－12）。2013年，van Setten et al［7］檢測了NELSON實驗中2 620男性個體的2 500 000個SNPs，結(jié)果顯示9p21區(qū)域與冠狀動脈鈣化顯著關(guān)聯(lián)（rs1537370，P＝2.3×10－11）。

2．1．2 美洲 Larson et al［8］在弗拉明翰心臟研究基礎(chǔ)上進行了一項以社區(qū)人群為基礎(chǔ)的心血管疾病

的GWAS，結(jié)果顯示9p21區(qū)域的位點與CAD存在關(guān)聯(lián)性［（P＝（2.5～3.5）×10－4）］。Polfus et al［9］認為GWAS把過多的目光集中于基因?qū)膊〉莫毩⒆饔蒙?，而忽略了環(huán)境與基因之間交互作用對疾病的影響。2013年在PLoS One上發(fā)表了一篇基因與環(huán)境交互作用的CAD GWAS研究，研究基因變異聯(lián)合吸煙等因素對冠狀動脈鈣化程度的影響。該研究的第一階段選取GENOA中的同胞共915例，重復(fù)驗證階段在FHS同胞中選取1 025名歐裔美國人，并采用廣義估計方程來解釋吸煙組與非吸煙組同胞之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示TBC1D4和ADAMTS9兩個基因在吸煙暴露的情況下與冠狀動脈鈣化顯著相關(guān)（P＝6.9×10－5，P＝7.1×10－5）。同時，這些基因也被發(fā)現(xiàn)參與炎性通路，這種現(xiàn)象可能是吸煙誘導(dǎo)慢性系統(tǒng)性炎癥而引起的。2014年，Lusk et al［10］在歐裔美國人群中證實了染色體9p21區(qū)域的基因型變異與CAD的關(guān)聯(lián)。研究者在ARIC研究中選取7 589名參與者（其中男性3 720名，女性3 869名），并選取了9p21區(qū)域的兩個標記SNPs位點：rs1333049和rs3217992。結(jié)果顯示這兩個標記SNPs位點與CAD密切相關(guān)（P＝0.001，OR＝1.17；P＜0.001，OR＝1.22）。

2．1．3 亞洲 2002年，Ozaki et al［5］運用GWAS技術(shù)首次在日本人群中發(fā)現(xiàn)了CAD的一個易感基因LTA，后期又發(fā)現(xiàn)LGALS2和BRAP基因與CAD有密切關(guān)聯(lián)。2012年，一項大型多階段病例對照研究設(shè)計的GWAS在日本人群中展開［11］。該研究的第一階段運用TaqMan assay技術(shù)對806例CAD病例和1 337例健康對照的451 382個SNPs進行檢測，以P＜5×10－8為統(tǒng)計學顯著性標準，在3 052例病例和6 335例對照的人群中進行重復(fù)驗證，結(jié)果顯示位于12q24上的BRAP和ALDH2、位于6p21的HLA-PQB1、位于9p21上的CDKN2A／2B基因與CAD顯著相關(guān)（P＝1.6×10－34，P＝4.7×10－7，P＝6.1×10－16）。Hirokawa et al［12］在2014年發(fā)表了一篇以日本人群為基礎(chǔ)的大型心肌梗死（myocardial infarction，MI）基因組分析。該研究第一階段采用Illumina Human610-Quad和HumanHap550v3 Genotyping兩種芯片對1 666例MI病例和3 198例健康對照進行基因型分型檢測，驗證階段使用11 412例MI病例及28 397例健康對照，結(jié)果顯示兩個新的MI易感基因位點：3p24.3上的PLCL2（rs4618210，P＝2.60×10－9，OR＝0.91）；19p13.3上的AP3D1-DOT1L-SF3A2（rs3803915，P＝3.84×10－9，OR＝ 0.89）。此外，該研究驗證了14個先前已報道的基因，通路分析結(jié)果還顯示這些位點可能通過促進動脈粥樣硬化而參與心肌梗死的發(fā)病過程。2013年，Lee et al［13］以韓國人群為基礎(chǔ)的進行了一項CAD GWAS研究，結(jié)果顯示1p13.3（rs99839）、9p21.3 （rs4977574）、11q22.3（rs974819）3個易感基因位點與CAD有顯著關(guān)聯(lián)。研究的前期階段Lee et al使用基因填補技術(shù)，成功保留了5 125 961個基因型。Hager et al［14］在黎巴嫩人群中展開了一項大型的隊列研究設(shè)計的CAD GWAS研究，研究的第一階段包括1 949名個體，驗證在另外的2 547名個體中進行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新的易感基因PHACTR1與CAD密切相關(guān)（OR＝1.34，P＝8.02×10－10）。

2．2 國內(nèi)現(xiàn)狀 相對于國外CAD GWAS方面的成就，國內(nèi)的發(fā)展較為滯后。國內(nèi)相關(guān)研究顯示，部分已發(fā)現(xiàn)的CAD易感基因位點在中國漢族人群中也得到驗證。Li et al［15］開展了一項以醫(yī)院為基礎(chǔ)的中國漢族人群的病例對照研究，旨在重復(fù)驗證國外CAD GWAS發(fā)現(xiàn)的9p21染色體區(qū)域，研究結(jié)果顯示MTAP基因上的rs101188757位點可能與漢族人群的缺血性腦卒中有關(guān)聯(lián)（OR＝1.31，P＝0.025）。進一步研究還顯示rs101188757位點和飲酒、高血壓共同作用于漢族人群缺血性腦卒中的發(fā)病過程。隨著國內(nèi)GWAS的進一步發(fā)展，越來越多新的CAD易感基因位點被發(fā)現(xiàn)。2011年，Wang et al［16］在Nature上首次發(fā)表了中國漢族人群的CAD GWAS，該研究采用三階段病例對照研究，以P＜0.01為統(tǒng)計學顯著標準來篩選陽性SNPs進入重復(fù)驗證階段。研究結(jié)果顯示，位于6p24．1上的C6orf105與CAD易感性顯著相關(guān)（rs6903956，OR＝1.51，P＝4.87× 10－12）。Chen et al［17］在漢族人群中開展了一項兩階段病例對照設(shè)計CAD GWAS，研究結(jié)果顯示KLF14（rs4731702）有助于降低心肌梗死的發(fā)生（OR ＝0.72，P＝3.85×10－3）。

3 Meta分析

Meta分析屬于描述性的二次研究，相對于傳統(tǒng)的描述性綜述而言，Meta分析可以對效應(yīng)指標進行更準確、客觀的評估，并能解釋不同研究結(jié)果間的異質(zhì)性。2012年，一篇包括2個中國漢族人群CAD GWAS的Meta分析在Nature上發(fā)表［18］。該研究第一階段包括CAD病例1 515名和健康對照5 019名，在重復(fù)驗證階段選取15 460 CAD病例和11 472名對照。該研究以P＜5×10－8為統(tǒng)計學顯著性標

準，結(jié)果顯示TTC32-WDR35、GUCY1A3、C6orf10-BTNL2及ATP2B1基因達到這一顯著性標準，與漢族人群CAD易感性有關(guān)聯(lián)。Davies et al［19］在10個大型CAD GWAS中采用Meta分析方法進行研究，研究的第一階段檢測了5個GWAS的7 123名病例和6 826名對照的近5 000 000個SNPs，隨后在另外的5個GWAS中的5 211名病例和5 821名對照中進行重復(fù)驗證。研究結(jié)果顯示，位于主要組織相容性復(fù)合體上的染色體6p21．3與CAD密切相關(guān)（rs3869109，P＝1.12×10－9）。2013年，Chan et al［20］在美國心臟病學會雜志中發(fā)表了一篇國際合作的Meta分析。該研究囊括了來自21個獨立研究的33 673名參與者，研究結(jié)果顯示9p21位點與CAD存在密切的關(guān)聯(lián)性（OR＝1．31，95%CI：1.20 ～1.43）。Meta分析與循證醫(yī)學的思想相符合，合理的運用可以促進CAD GWAS的發(fā)展，并增加研究結(jié)果的可信度，故Meta分析可能會成為未來CAD GWAS的主導(dǎo)方法之一。

4 CAD GWAS研究的挑戰(zhàn)性

4．1 提高HapMap數(shù)據(jù)進行基因型填補的力度基因型填補是指依據(jù)已分型位點的基因型對數(shù)據(jù)缺失的位點或未分型位點進行基因型預(yù)測的方法。對分型缺失率較高的基因芯片利用HapMap數(shù)據(jù)進行填補可以提高全基因組遺傳標記的覆蓋率及研究效率，增加陽性關(guān)聯(lián)位點的篩查成功率。根據(jù)Hap-Map數(shù)據(jù)進行基因型填補首先要利用HapMap數(shù)據(jù)，獲得單體型信息，再根據(jù)樣本觀察到的基因型推測該樣本最有可能攜帶的單體型，并據(jù)此將該單體型上相應(yīng)位點的等位基因作為最有可能的填補值。目前在GWAS中，較為常用的填補軟件包括：MACH、Impute和fastPHASE。另外，PLINK、TUNG 和BEAGKE等數(shù)據(jù)分析軟件也包含了填補模塊。HapMap將為研究人員提供對人類健康和疾病以及對藥物和環(huán)境的反應(yīng)有影響的相關(guān)基因的關(guān)鍵信息。然而，檢查填補后的數(shù)據(jù)往往可以顯示，盡管填補后位點的個數(shù)增加了，部分位點仍然存在缺失值。故填補不是萬能的金鑰匙，想要達到理想的標準，相關(guān)問題仍需處理，如在填補之后，在分析時設(shè)定一些條件，剔除缺失比例仍然較高的位點，以及填充質(zhì)量欠佳的位點。

4．2 深化基因－基因、基因－環(huán)境間交互作用的研究 現(xiàn)階段的CAD GWAS將CAD的發(fā)病機理歸結(jié)為多個獨立的易感位點和區(qū)域，弱化了其位點－位點之間、遺傳－環(huán)境之間的交互作用。不同的環(huán)境外暴露混合后，暴露的混雜效應(yīng)會削弱研究的把握度，致使大量的易感位點或區(qū)域被掩蓋。Polfus et al［9］認為全基因組關(guān)聯(lián)研究把過多的目光集中于基因?qū)膊〉莫毩⒆饔蒙?，而忽略了環(huán)境與基因之間交互作用對疾病的影響，2013年在PLoS One上發(fā)表了一篇基因與環(huán)境交互作用的CAD GWAS研究，研究基因變異聯(lián)合吸煙因素對冠狀動脈鈣化程度的影響。結(jié)果顯示TBC1D4和ADAMTS9兩個基因在吸煙暴露的情況下與冠狀動脈鈣化顯著相關(guān)（P＝6.9×10－5，P＝7.1×10－5）。Zhang et al［21］創(chuàng)建了一個新的統(tǒng)計學方法PLSPM來檢測基因－基因間的交互作用，研究結(jié)果顯示該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性回歸模型、PCA模型及其他基因模型。

4．3 國際合作和Meta分析的運用 GWAS多采用兩階段和多個階段研究，其樣本量一般在1 000以上，巨大的樣本量使得研究對象的選取受限且耗費大量人力、物力及財力。然而，對于病例對照研究來說樣本量越大研究的可信度就越大，特別是第一階段的樣本量對研究的影響更大。對于上述問題，Meta分析可以很好地解決。Meta分析通過合并多個研究的數(shù)據(jù)來增加樣本量，從而提高檢驗效能。2011年，CARDIOGRAM協(xié)會運用Meta分析原理收集了14個關(guān)于冠心病及心肌梗死的GWAS數(shù)據(jù)［22］，其中包括22 233個病例及64 762個健康對照，樣本人群均為歐洲血統(tǒng)。該研究顯示了13個新的易感位點，并同時證實至少10個既往已有報道的易感位點。雖然GWAS的Meta分析在探索易感基因方面取得很多顯著性的成就，但是隨著樣本量的不斷增加，樣本之間的異質(zhì)性也會不斷地凸顯出來，如何平衡樣本量和異質(zhì)性之間的矛盾關(guān)系是需要深入探究的話題。

4．4 GWAS的研究成果轉(zhuǎn)換 首先，雖然GWAS在探尋CAD易感基因方面取得了很大成功，但是目前得到的GWAS結(jié)果只能解釋小部分的CAD遺傳發(fā)病機制，大部分的遺傳易感基因仍未被發(fā)現(xiàn)。其次，已顯示研究成果絕大部分未被運用到臨床實踐，僅少數(shù)在藥物研制得到初步運用，例如藥物基因組學通過5－脂氧化酶通路的CAD易感基因研究開發(fā)了抑制該通路酶活性的物質(zhì)和受體拮抗劑［23］。這些新開發(fā)的藥物，有望在使用降脂藥物治療CAD的基礎(chǔ)上更好地控制和治療CAD。在個體化治療方面，由于每個個體間的遺傳差異，治療方法也不盡相同。如何有效地將GWAS研究成果用于診斷、預(yù)

防及治療CAD將成為未來CAD GWAS的重要研究領(lǐng)域。

5 展望

隨著人類基因組單倍型圖計劃以及“國際千人基因組計劃”的完成，人類已經(jīng)步入后基因組時代。后基因組時代，基因組研究的重心已由測定基因的DNA序列轉(zhuǎn)移到從分子整體水平對生物學功能的研究上，在分子層面上探索人類健康和疾病的秘密。相信GWAS的不斷完善會使得CAD的遺傳機制越來越清晰，那時研究關(guān)注的重點則是如何將GWAS的研究成果有效地服務(wù)于臨床實踐，更好地服務(wù)人類的健康事業(yè)，從而推動人類冠心病的預(yù)防和治療，降低冠心病發(fā)病率、致殘率和死亡率，提高人類的健康水平和生活質(zhì)量。

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作者簡介：高 敏，女，副主任醫(yī)師，責任作者，E-mail：gmbeauty＠163．com

基金項目：2012年安徽省青年自然基金項目（編號：1208085QH155）作者單位：1安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院心電科，合肥 230001

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）04－0558－04

中圖分類號R 541．4