文∕何 瑛 林木娣 吳 騰 邢益俊

（廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司檢測中心）

牛奶富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，被稱為“白色血液”，是為數(shù)不多的全價(jià)食品之一，也是微生物生長繁殖的良好培養(yǎng)基，一旦與外界接觸就極易受到污染，細(xì)菌總數(shù)是其衛(wèi)生質(zhì)量的重要監(jiān)控指標(biāo)。

國標(biāo)GB 19301—2010規(guī)定，當(dāng)生乳中細(xì)菌總數(shù)達(dá)到2×106CFU/mL時(shí)，牛奶的質(zhì)量安全就會(huì)受到威脅，此時(shí)生乳不允許用作原料乳。生乳的細(xì)菌總數(shù)與乳制品后期生產(chǎn)加工及儲(chǔ)存密切相關(guān)，細(xì)菌總數(shù)過多，生乳容易發(fā)生酸敗，導(dǎo)致保質(zhì)期縮短、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性下降而無法加工或者在加工過程中需要更苛刻的條件才能達(dá)到滅菌效果，不僅破壞了牛奶的營養(yǎng)成分，還可能由于滅菌不完全帶來潛在質(zhì)量問題。此外，生乳中大量的細(xì)菌生長繁殖極易產(chǎn)生耐熱性的酶及毒素，它們經(jīng)超高溫處理后仍有殘留，容易引起UHT產(chǎn)品在貨架期內(nèi)變質(zhì)或?qū)е孪M(fèi)者中毒事件發(fā)生[1]。

檢測生乳中細(xì)菌總數(shù)的方法很多，傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法是應(yīng)用最廣泛的，但該法需48 h才能完成菌落計(jì)數(shù)，不能及時(shí)把握原料乳的衛(wèi)生質(zhì)量狀況。近年來，細(xì)菌總數(shù)的快速檢測技術(shù)得到了很大的發(fā)展，如電化學(xué)阻抗法[2]、ATP生物發(fā)光法[3]、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法[4]、還原法[5]、微生物自動(dòng)檢測儀等[6]。Soleris實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測系統(tǒng)是一種新興的微生物自動(dòng)檢測技術(shù)，它基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)基理論和染色技術(shù)，并結(jié)合了光電檢測技術(shù)和計(jì)算機(jī)控制的模塊化分析系統(tǒng)研發(fā)而成，被UPS推薦為替代傳統(tǒng)平板的有效方法之一，在國外已成功應(yīng)用于液態(tài)奶中微生物的檢驗(yàn)[7]。本文參照國標(biāo)GB 4789.2—2010方法和Soleris方法進(jìn)行同步實(shí)驗(yàn)，研究建立Soleris系統(tǒng)快速檢測生乳中細(xì)菌總數(shù)的方法模型，為生乳細(xì)菌總數(shù)的測定提供了一種簡單、快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生乳

采自廣東、福建、廣西等地的大型奶牛場。

1.1.2 試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA，北京陸橋），0.85%滅菌生理鹽水，Soleris細(xì)菌總數(shù)試劑瓶（美國Neogen公司）。

1.1.3 儀器設(shè)備

移液槍（德國Brand），渦旋振蕩器（海太牌），恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒）；

Soleris實(shí)時(shí)光電微生物快速檢測系統(tǒng)，美國Neogen公司生產(chǎn)，可內(nèi)置128個(gè)試劑瓶，光電檢測器每隔6 min監(jiān)測試劑瓶底部瓊脂栓的顏色變化并傳輸?shù)接?jì)算機(jī)。

1.2 方法建立

1.2.1 工作原理

Soleris系統(tǒng)在預(yù)制的試劑瓶中放入營養(yǎng)培養(yǎng)基（內(nèi)含以葡萄糖為碳源的蛋白胨酵母抽提物）和pH值指示劑（溴甲酚紫），在35℃培養(yǎng)環(huán)境下，樣品中的細(xì)菌在Soleris試劑瓶中增殖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH值改變，繼而引起指示劑顏色的變化，通過系統(tǒng)自帶的光電系統(tǒng)監(jiān)測試劑瓶底部瓊脂栓顏色發(fā)生改變的時(shí)間來計(jì)算樣品的細(xì)菌數(shù)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

本實(shí)驗(yàn)將取自各地牧場的細(xì)菌數(shù)各異的生乳樣品，按照GB 4789.2—2010的方法[8]選擇合適的稀釋度進(jìn)行平板培養(yǎng)，同時(shí)取1 mL樣品原液加入Soleris菌落總數(shù)檢測試劑瓶中，上機(jī)檢測。國標(biāo)方法獲得樣品細(xì)菌總數(shù)（CFU/mL），Soleris儀器獲得相應(yīng)的瓊脂栓變色時(shí)間（DT），由此建立細(xì)菌總數(shù)和DT之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，剔除偏離回歸曲線較大的點(diǎn)，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線用于樣品的定量檢測。

1.2.3 儀器重復(fù)性試驗(yàn)

選取細(xì)菌數(shù)在不同數(shù)量級(jí)的樣品，標(biāo)號(hào)為A1～A9，使用Soleris系統(tǒng)分別重復(fù)測定3 次，將得到的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差用RSD表示。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證

調(diào)試儀器處于正常的檢測狀態(tài)，隨機(jī)選取不同時(shí)期各奶牛場的生乳樣品不少于30個(gè)，同時(shí)按照Soleris儀器法和國標(biāo)平板計(jì)數(shù)法對(duì)樣品細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測，記錄儀器檢出時(shí)間（DT），將DT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到儀器菌落數(shù)，與對(duì)應(yīng)的平板法菌落總數(shù)進(jìn)行比較，并對(duì)2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取來自廣東、福建、廣西等地牧場的生乳樣品共102個(gè)，將樣品在Soleris儀器上測得的指示劑變色時(shí)間（DT）設(shè)為橫坐標(biāo)，國標(biāo)平板計(jì)數(shù)法測得的細(xì)菌總數(shù)結(jié)果（CFU/mL）取對(duì)數(shù)值（Log CFU）后設(shè)為縱坐標(biāo)，得到Log CFU與DT值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

對(duì)Soleris儀器法與國標(biāo)法的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到生乳細(xì)菌總數(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Log CFU＝7.634－0.472×DT，相關(guān)系數(shù)R2＝－0.93，表明2 種方法所得結(jié)果具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為負(fù)數(shù)，即細(xì)菌數(shù)與DT值為負(fù)相關(guān)，細(xì)菌數(shù)越高檢測時(shí)間越短，有利于加快企業(yè)對(duì)高污染生乳樣品的預(yù)警。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線可得，國標(biāo)生乳細(xì)菌總數(shù)的限量水平為2×106CFU/mL，DT值約為2.8 h；若設(shè)定生乳細(xì)菌總數(shù)低于5×105CFU/mL，DT值約為4.1 h；當(dāng)生乳細(xì)菌數(shù)低至103CFU/mL[1]時(shí)，DT值約為9.8 h，同國標(biāo)方法完成菌落計(jì)數(shù)所需48 h相比，Soleris方法可以大大縮短檢測時(shí)間。

圖1 生乳細(xì)菌總數(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 Soleris 儀器法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取生乳樣品9個(gè)，編號(hào)為A1～A9，使用Soleris系統(tǒng)分別重復(fù)測定3 次，得到的數(shù)據(jù)見表1。該方法測得數(shù)據(jù)的RSD值均在5%以內(nèi)，表明儀器檢測結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的合理性，隨機(jī)抽取各奶牛場生乳樣品51 批次進(jìn)行Soleris儀器法檢測，得出DT值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出細(xì)菌總數(shù)，同時(shí)進(jìn)行國標(biāo)法平板計(jì)數(shù)，驗(yàn)證結(jié)果見表2。由于微生物檢測存在一定的誤差，2 種方法測得結(jié)果的對(duì)數(shù)值可接受偏差范圍為±0.5，由表2可以看出，2 組對(duì)數(shù)值偏差的絕對(duì)值均小于0.5。認(rèn)為標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度達(dá)到檢測要求；對(duì)2 組細(xì)菌總數(shù)作t檢驗(yàn)，t＝1.869＜t0.05/2.50=2.009（P＜0.05），表明2 組數(shù)據(jù)之間沒有顯著性差異，Soleris法可以滿足生乳中細(xì)菌數(shù)檢測的定量要求。

3 總結(jié)

表1 儀器法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（n ＝3）

3.1 本實(shí)驗(yàn)建立了Soleris儀器法快速檢測生乳中細(xì)菌總數(shù)的方法模型，該方法操作簡便、實(shí)時(shí)快速，可進(jìn)行批量檢測，與國標(biāo)法有較好的一致性，重復(fù)性良好且自動(dòng)化程度高，能有效避免人為誤差，對(duì)于生乳細(xì)菌總數(shù)檢測具有良好的適應(yīng)性，為企業(yè)快速評(píng)估生乳的衛(wèi)生質(zhì)量狀況、指導(dǎo)生產(chǎn)、控制產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了決策依據(jù)。

3.2 Soleris法使用的關(guān)鍵是建立一條覆蓋面廣、具有代表性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的相關(guān)系數(shù)不僅取決于2個(gè)方法之間的相關(guān)性，更與參與分析的樣品數(shù)量、樣品細(xì)菌數(shù)范圍、傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性等因素息息相關(guān)。隨著分析樣品數(shù)量的增加，樣品細(xì)菌數(shù)范圍覆蓋5～6個(gè)指數(shù)級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線描述的2 種方法之間的關(guān)系就越可靠，因此在日常檢驗(yàn)的過程中應(yīng)不斷添加新數(shù)據(jù)以完善標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.3 由于各奶牛場奶牛品種、飼養(yǎng)條件、環(huán)境衛(wèi)生等的差異，污染生乳的細(xì)菌來源復(fù)雜，不同牧場的生乳樣品菌相不盡相同，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的適用性也有一定的差異，當(dāng)需要檢測新來源的生乳樣品時(shí)，需要通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)曲線進(jìn)行校正或者重新制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證結(jié)果

[1]汪銀鋒，李素平，高騰云，等.原料乳衛(wèi)生指標(biāo)與質(zhì)量關(guān)系的研究.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21（8）：147-149.

[2]易敏英，李志勇.電阻抗法快速檢測鮮牛奶中細(xì)菌總數(shù).中國乳品工業(yè)，2001，29（3）：30-31.

[3]李春艷，霍貴成，王德國，等.ATP生物發(fā)光法快速測定生乳中微生物總數(shù)的研究.食品工業(yè)科技，2008，29（7）：233-238.

[4]王寧，劉寧.流式細(xì)胞術(shù)快速檢測生乳中細(xì)菌總數(shù).食品工業(yè)科技，2007，28（9）：197-200.

[5]富鑫，田雨，管勇佳，等.生乳細(xì)菌總數(shù)檢測儀測定生乳細(xì)菌總數(shù)的應(yīng)用.食品工業(yè)科技，2012，33（2）：70-72.

[6]孔麗娜，李祖明，吳聰明，等.生乳微生物快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展.食品研究與開發(fā)，2013，34（24）：268-271.

[7] 北京安普生化科技有限公司.Soleris系統(tǒng)在乳制品微生物快速檢測領(lǐng)域的應(yīng)用.食品安全導(dǎo)刊，2012（7）：34-35.

[8]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.2-2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.