林忠喬，李雅娟，張賽賽，姜志強，王偉，王玉生

（農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023）

天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)條件優(yōu)化

林忠喬，李雅娟*，張賽賽，姜志強，王偉，王玉生

（農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023）

為探索安全、易操作的魚類雄核發(fā)育新途徑。以天然四倍體泥鰍為父本，二倍體泥鰍為母本人工催產(chǎn)授精，冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體。試驗選用L9（34）設(shè)計，進(jìn)行三因素三水平正交試驗，受精后時間為A，設(shè)0、5和10 min；處理溫度為B，設(shè)0、3和6℃；處理時間C，設(shè)45、60和75 min。染色體倍性鑒定采用單個胚胎染色體計數(shù)法。結(jié)果表明，最高雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率為63.33%；根據(jù)正交試驗直觀分析結(jié)果，得出誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體各因素最優(yōu)水平組合：受精后5 min，處理溫度3℃，處理時間60 min；影響雄核發(fā)育三因素主次順序為：受精后時間→處理溫度→處理時間。

天然四倍體泥鰍；冷休克；雄核發(fā)育二倍體；正交試驗

網(wǎng)絡(luò)出版時間2015-12-28 13:49:05[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151228.1349.004.html

林忠喬,李雅娟,張賽賽,等.天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(12):58-64.

Lin Zhongqiao,Li Yajuan,Zhang Saisai,et al.Optimizer of induction androgenetic dipoid in natural tetraploid loach[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):58-64.(in Chinese with English abstract)

雄核發(fā)育（Androgenesis）是指用精子生產(chǎn)只含父系遺傳物質(zhì)的個體繁殖方式[1]。雄核發(fā)育遺傳物質(zhì)完全來自父本，在生產(chǎn)和科研上，具有快速建立純系、性別決定機制判別、單性種群利用、保護(hù)瀕危魚類、遺傳分析、隱性基因檢測等特殊優(yōu)勢作用[2]。目前，人工誘導(dǎo)魚類雄核發(fā)育途徑有兩種：第一種是二倍體魚類，經(jīng)卵子遺傳失活，染色體加倍獲得純合雄核發(fā)育二倍體。實現(xiàn)該途徑需解決卵子染色體遺傳失活及染色體加倍兩個關(guān)鍵問題?，F(xiàn)有使卵子染色體遺傳失活最常用的方法有電離輻射（γ射線、Х射線）或紫外線（UV）照射等，應(yīng)用輻射方法對卵子的遺傳物質(zhì)滅活簡便易行，但射線在破壞卵子細(xì)胞核的同時，對細(xì)胞質(zhì)和其他細(xì)胞器也造成不同程度破壞，此卵子受精后，單倍體雖能較好地通過胚胎發(fā)育，但到孵化期或孵化后數(shù)天，會因“單倍體綜合癥”而陸續(xù)死亡。染色體加倍主要利用溫度、壓力刺激或化學(xué)誘變劑阻止第一次卵裂，但所獲二倍體存活率極低。第二種是四倍體魚類，只經(jīng)卵子遺傳失活，無需染色體加倍即可獲得雜合雄核發(fā)育二倍體。實現(xiàn)此途徑需具有四倍體雄魚，但人工誘導(dǎo)四倍體難度大，且該途徑也需卵子遺傳失活，成活率較低。最近，Morishima等報道3℃冰水處理泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）受精卵60 min能誘導(dǎo)產(chǎn)生雄核發(fā)育后代[3]。Hou等進(jìn)行人工誘導(dǎo)四倍體泥鰍的冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體研究[4]。

大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室利用3℃冰水處理大鱗副泥鰍受精卵60 min，成功誘導(dǎo)雄核發(fā)育單倍體，并探討雄核發(fā)育的細(xì)胞學(xué)機制是卵核與第二極體一同釋放[5]。因此，利用天然四倍體魚類，探索無需卵子失活及不經(jīng)染色體加倍處理，快速、高效生產(chǎn)雄核發(fā)育二倍體具有可行性。

近10年本實驗室對我國長江流域特有的天然四倍體泥鰍進(jìn)行系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體（4n= 100）、是同源四倍體、能產(chǎn)生正常的2n配子（雌或雄）[6-9]。因此，本試驗以天然四倍體泥鰍為父本，二倍體泥鰍為母本人工催產(chǎn)授精，冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體，運用正交試驗設(shè)計，探討冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育二倍體的適宜條件。旨在探索既不需要卵子遺傳失活，也不需要染色體加倍的安全、易操作的魚類雄核發(fā)育新途徑，為提高人工誘導(dǎo)魚類雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率和成活率提供技術(shù)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料

天然四倍體泥鰍（4n=100）（♂）取自湖北省赤壁市，倍性經(jīng)血紅細(xì)胞核體積測量和流式細(xì)胞儀檢測確定。二倍體泥鰍（2n=50）（♀）取自大連市農(nóng)貿(mào)市場，暫養(yǎng)于細(xì)胞遺傳與工程實驗室水族箱中，溫度（22±1）℃。

1.2方法

1.2.1人工催產(chǎn)及授精

挑選天然四倍體雄魚和大連本地二倍體雌魚，注射絨毛膜促性腺激素（HCG）（注射劑量：♀20～25 UI·尾-1，♂減半）人工催產(chǎn)，12 h后確認(rèn)雌魚排卵情況，輕壓二倍體雌魚腹部若有卵排出，用稀釋1 000倍的苯甲醇將泥鰍麻醉，待雌魚麻醉后，擠卵，將卵收集到鋪有保鮮膜的9 cm培養(yǎng)皿中，用毛細(xì)管收集精液于1.5 mL塑料離心管中（用精子稀釋液稀釋100倍），光學(xué)顯微鏡下觀察精子活力。

1.2.2試驗設(shè)計

試驗選用L9（34）設(shè)計，三因素三水平正交試驗，試驗設(shè)計見表1，受精后時間為A，設(shè)0、5和10 min；處理溫度為B，設(shè)0、3和6℃；處理時間C，設(shè)45、60和75 min。影響雄核發(fā)育二倍體率三因素主次順序和最優(yōu)水平組合以直觀分析法獲得。

表1　正交試驗設(shè)計Table 1Orthogonal test design

1.2.3冷休克處理

受精后0、5、10 min時將受精卵分別放入0、3和6℃中，處理45、60、75 min后，將受精卵放入（20±1）℃曝氣水中孵化。

1.2.4胚胎染色體倍性鑒定

采用單個胚胎染色體計數(shù)法。取發(fā)育至肌肉效應(yīng)期的胚胎30～50個，剝?nèi)ヂ涯ず吐腰S，0.0025%秋水仙素處理45 min，0.8%檸檬酸低滲20 min，用預(yù)冷的卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定3次，每次15～20 min，-20℃冷凍過夜。次日冷滴片，室溫下自然風(fēng)干，10%吉姆薩染液染色30 min，自來水沖洗，自然風(fēng)干。普通光學(xué)顯微鏡下選擇分散均勻、圖像清晰的中期分裂相觀察拍照。每個處理統(tǒng)計30個單個胚胎染色體數(shù)目。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

魚卵發(fā)育至原腸晚期時統(tǒng)計受精率（受精卵數(shù)占總卵數(shù)的百分?jǐn)?shù)）；魚卵發(fā)育至孵出前期時統(tǒng)計孵化率（孵化苗數(shù)占受精卵數(shù)的百分?jǐn)?shù)）；開口攝食時統(tǒng)計成活率（成活胚胎占總受精卵數(shù)的百分?jǐn)?shù)）。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理組染色體數(shù)目分布

通過染色體計數(shù)法分析正交試驗1～9組單個胚胎（30個·組-1）的染色體數(shù)目組成，結(jié)果表明，不同處理組均出現(xiàn)不同頻率的整倍體和非整倍體，整倍體中有雄核發(fā)育二倍體（2n=50）（見圖1a）、正常三倍體（3n=75）（見圖1b）及四倍體（4n=100）（見圖1c）。雄核發(fā)育二倍體率最高是第5組即受精后5 min，處理溫度3℃，處理75 min，2n=50有19個，眾數(shù)百分比為63.33%（見圖2 e），其次是第4組即受精后5 min，處理溫度0℃，處理60 min，2n=50有18個，眾數(shù)百分比為60%（見圖2 d）。同時在1、2、3、6、7及9組發(fā)現(xiàn)頻率不同的四倍體（見圖2 a，b，c，f，g，i），其中，第2組即受精后0 min，處理溫度3℃，處理60 min，4n=100有8個，眾數(shù)百分比最高為26.67%（見圖2 b）。

圖1　胚胎染色體中期分裂相Fig.1Metaphase spread of embryo

圖2　正交試驗各組胚胎染色體數(shù)目分布頻率Fig.2Distribution frequency of number of chromosome at embryo period in each group of the orthogonal text

2.2正交試驗結(jié)果

根據(jù)直觀分析結(jié)果見表2。由表2可知，極差R值，影響雄核發(fā)育3因素主次順序為：受精后時間→處理溫度→處理時間。為更直觀了解雄核發(fā)育與各因素水平變化情況，作各因素水平對二倍體率效應(yīng)圖。

據(jù)圖3可知，A和B因素折線圖中的直線陡度較大，說明二者對雄核發(fā)育二倍體的效應(yīng)大，為主要因素，C因素為次要因素。得到最優(yōu)水平組合：受精后5 min、處理溫度3℃、處理時間60 min。

表2　正交試驗結(jié)果及直觀分析Table 2Results of orthogonal test and intuitive analysis

圖3　三因素水平對雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率的效應(yīng)Fig.3Effects of the three factors and their levels on diploidy

3　討論與結(jié)論

利用不同溫度處理受精卵得到單倍體后代方法，目前國內(nèi)外鮮有報道。Gervai等發(fā)現(xiàn)利用冷休克處理鯉魚受精卵[10]，除三倍體外，也發(fā)現(xiàn)高頻率的雄核發(fā)育單倍體胚胎。Ueda報道虹鱒魚受精后30 s或3.5 h后用30℃熱水處理7 min可獲得低頻率的雄核發(fā)育二倍體個體[11]。近來Morishima等報道3℃冰水處理泥鰍受精卵60 min可產(chǎn)生雄核發(fā)育后代[3]。王玉生等報道3℃冰水處理大鱗副泥鰍受精卵60 min可產(chǎn)生雄核發(fā)育單倍體[5]。上述方法可克服射線處理卵核造成的低成活率問題，成本低、易操作、有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用，在遺傳育種方面有重要意義。

關(guān)于冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育的細(xì)胞學(xué)機制，Gervai等認(rèn)為雄核發(fā)育可能是冷休克損傷雄性或雌性原核[10]。Morishima等[3]、王玉生等[5]通過受精細(xì)胞學(xué)觀察認(rèn)為雄核發(fā)育是雌性原核和第二極體的共同釋放。因此，冷休克誘導(dǎo)雄核發(fā)育的三大要素（處理起始時間，處理溫度及處理時間）中處理起始時間尤為重要，處理晚第二極體釋放，處理早可能極體尚未釋放，無法產(chǎn)生作用。本研究發(fā)現(xiàn)泥鰍在（20±1）℃情況下受精后10 min釋放第二極體。趙振山等研究發(fā)現(xiàn)[12]，大鱗副泥鰍卵與泥鰍精子受精后6～9 min時雌核膨脹核化，并向卵子內(nèi)部移動，也間接說明6～9 min時第二極體已排出卵外。本試驗中，雄核發(fā)育二倍體率較高的第4組（60%）和第5組（63.33%），均為受精后5 min開始低溫處理，而在受精后0、10 min時對受精卵冷休克處理，所得二倍率普遍較低，這可能是由于此時第二極體尚未形成或已排出體外，低溫處理無法再對其產(chǎn)生影響所致，出現(xiàn)二倍體率低的現(xiàn)象，因此判定受精后5 min左右冷休克處理效果最佳。

另外，處理溫度對胚胎發(fā)育過程的極體釋放以及第一次卵裂也有較大影響。目前，利用溫度誘導(dǎo)多倍體報道很多，王軍等在受精后2 min時對大黃魚受精卵低溫（3～4℃）處理8～10 min[13]，得到34%三倍體誘導(dǎo)率。蔡國雄在受精后5 min時[14]，用1.5℃冰水處理真鯛受精卵，得到17%三倍體和28%嵌合體。張新輝等以孵化溫度26～27℃、受精后3 min以0～2℃處理25 min誘導(dǎo)團(tuán)頭魴三倍體率為60.67%[15]，根據(jù)冷休克抑制第二極體釋放的方式誘導(dǎo)團(tuán)頭魴三倍體。另外斑馬魚（Danio rerio）[16]、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）[17]、刺鯰魚（Silurus asotus）[18]、斑點叉尾鮰（Letalurus punetaus）[19]等在早期胚胎發(fā)育過程中，用熱休克適當(dāng)處理可得到三倍體和四倍體。吳玉萍等對斑馬魚熱休克（39℃）處理，三倍體誘導(dǎo)率為53.8%[16]。王軍等在大黃魚受精后2.5 min時37℃處理5 min[13]，也可獲得較高三倍體誘導(dǎo)率。說明適當(dāng)溫度處理使雜交后代倍性增長或加倍。本研究發(fā)現(xiàn)，在泥鰍胚胎發(fā)育早期利用不同溫度（0、3、6℃）處理不同時間，經(jīng)早期單個胚胎染色體數(shù)目觀察發(fā)現(xiàn)，正交試驗各組中除有雄核發(fā)育二倍體（2n=50）和正常三倍體（3n=75）胚胎外，部分組中還出現(xiàn)四倍體（4n= 100）現(xiàn)象，其形成機制可能是二倍體雌魚與四倍體雄魚雜交，冷休克抑制受精卵第二極體釋放形成二倍體卵核再與四倍體雄魚產(chǎn)生的二倍體精核結(jié)合形成四倍體，其細(xì)胞學(xué)機制有待進(jìn)一步研究。以往報道人工誘導(dǎo)魚類四倍體形成途徑主要是抑制卵裂，但難度大，成功率低。

本研究發(fā)現(xiàn)，在第2組即受精后0 min，處理溫度3℃，處理60 min，4n=100有8個（26.67%）。說明利用二倍體與四倍體雜交冷休克處理受精卵可獲得四倍體，為人工誘導(dǎo)魚類四倍體提供新途徑。

本研究運用正交試驗，篩選到天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體冷休克誘導(dǎo)適宜參數(shù)，即受精后5 min、處理溫度3℃、處理時間60 min，雄核發(fā)育二倍體率最高為63.33%。3因素主次順序為：受精后時間→處理溫度→處理時間。結(jié)果表明，無需卵子失活及染色體加倍，僅用冷休克可成功誘導(dǎo)天然四倍體泥鰍雄核發(fā)育二倍體，雄核發(fā)育二倍體率高達(dá)63.33%。為提高人工誘導(dǎo)魚類雄核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率和成活率提供參考。

[1]范兆廷,宋蘇祥.魚類的雌核發(fā)育雄核發(fā)育和雜種發(fā)育[J].水產(chǎn)學(xué)報,1993,17(2):179-187．

[2]趙振山,吳清江,高貴琴．魚類雄核發(fā)育的研究進(jìn)展[J].遺傳學(xué)報,2000,22(2):109-113．

[3]Kagayaki M,Takafumi F,Mami S,et al.Cold-shock eliminates female nucleus in fertilized eggs to induce androgenesis in the loach(Misgurnus anguillicaudatus),a teleost fish[J].Bio Med Central Biotechnology,2011,11(76):116.

[4]Jilun Hou,Takafumi Fujimoto,Etsuro Yamaha,et al.Production of androgenetic diploid loach by cold-shock of eggs fertilized with diploid sperm[J].Theriogenology,2013,80:125-130.

[5]王玉生,李雅娟,于長寧,等.冷休克誘導(dǎo)大鱗副泥鰍雄核發(fā)育單倍體的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報,2014,38(2):161-169.

[6]Li Y J,Tian Y,Zhang M Z,et al.Chromosome banding and FISH with rDNA probe in the diploid and tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus[J].Ichthyological Research,2010,57(4):358-366.

[7]Li Y J,Yu Z,Zhang M Z,et al.The origin of natural tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus(Teleostei:Cobitidae)inferred from meiotic chromosome configurations[J].Genetica,2011,139: 805-811.

[8]Li Y J,Yu Z,Zhang M Z,et al.Induction of viable gynogenetic progeny using eggs and UV-irradiated sperm from the Chinese tetraploidloach,Misgurnusanguillicaudatus[J].Aquaculture International,2013,21(4):759-768.

[9]Li Y J,Zhang M Z,Qian C,et al.Fertility and ploidy of gametes of diploid,triploid and tetraploid loaches,Misgurnus anguillicaudatus,in China[J].Journal of Applied Ichthyology,2012,28(6): 900-905.

[10]Gervai J,Páter S,Nagy A,et al.Induced triploidy in carp, Cyprinus carpio L.[J].Journal of Fish Biology,1980,17(6):667-671.

[11]Ueda T.The possible induction of androgenetic diploid rainbow trout by an application of heat-shock[J].Chromosome Information Service,1996,61(1):12-13.

[12]趙振山,曹志華.大鱗副泥鰍卵與泥鰍精子雜交受精細(xì)胞學(xué)的觀察[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1999,18(1):75-77.

[13]王軍,尤鋒.大黃魚三倍體誘導(dǎo)的初步研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2001,40(4):927-928.

[14]蔡國雄.真鯛三倍體誘導(dǎo)初步研究[J].熱帶海洋,1997,16(4): 95-98.

[15]張新輝,羅偉,高澤霞,等.團(tuán)頭魴三倍體的誘導(dǎo)及其鑒定[J].水產(chǎn)科學(xué),2013,32(9):503-507.

[16]吳玉萍,葉玉珍,吳清江.熱休克誘導(dǎo)斑馬魚異源三倍體的研究[J].海洋與湖沼,2000,31(5):465-470.

[17]Zou S,Li S,Cai W,et al.Establishment of fertile tetraploid population of blunt snout bream(Megalobrama amblycephala)[J]. Aquaculture,2004,238(1):155-164.

[18]Haniff M A,Sridhar S,Nagarajan M.Induction of triploidy and tetraploidy in stinging catfish Heteropneustes fossilis(Bloch),using heat shock[J].Aquac Res,2004,35(10):937-942.

[19]Bidwell C A,Chrisman C L,Libey G S.Polyploidy induced by heat shock in channel catfish[J].Aquaculture,1985,51(1):25-32.

Optimizer of induction androgenetic dipoid in natural tetraploid loach/

LIN Zhongqiao,LI Yajuan,ZHANG Saisai,JIANG Zhiqiang,WANG Wei,WANG Yusheng(Dalian Ocean University Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's sea, Ministry of Agriculture,Dalian Liaoning 116023,China)

In order to explore a new safe,easy operated approach of ichthyic androgenotes,used natural tetraploid loach as male parent and diploid one as female parent,to fertilized and hasten parturition manually,and induced androgenetic diploid loach by cold-shock of eggs fertilized with diploid sperm in this study.The orthogonal experiment of three factors and three levels[L9(34)]was used.The time after fertilization was A:0,5,10 min;processing temperature was represented as B:0, 3,6℃;processing time was represented as C:45,60,75 min.The identification of chromosome ploidy used counting method of singe embryo chromosome.The highest induction rate of androgenote diploid was 63.33%;according to the result of orthogonal experimental,could know the optimal solution of induction androgenetic diploid loach with the combination of several factors:5 minutes after fertilization, the oosperm was treated under 3℃for 60 minutes.The three factors affect androgenesis could be ranked as follow:fertilization time,processing temperature and processing time.

natural tetraploid loach;cold-shock;androgenesis diploid;orthogonal text

S966.4；S917.4

A

1005-9369（2015）12-0058-07

2015-02-11

國家自然科學(xué)基金（31272650）；大連海洋大學(xué)博士啟動基金項目（017208）

林忠喬（1990-），男，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物良種繁育。E-mail:linzhongqiao90@163.com

李雅娟，教授，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn