張羽男，殷和美，張宇，趙巍，劉立新，張大俊，匡海學

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省藥學研究所，佳木斯大學，黑龍江佳木斯 154007）

以4，4'-聯(lián)吡啶為配體的木犀草素藥物共晶的合成及表征

張羽男1,2，殷和美2，張宇2，趙巍2，劉立新2，張大俊2，匡海學1＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；2.黑龍江省藥學研究所，佳木斯大學，黑龍江佳木斯 154007）

利用溶液揮發(fā)法首次合成1個全新的木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶藥物共晶，并通過紅外光譜、核磁共振、X射線粉末衍射及差示掃描熱量分析等對其表征。選擇不同物質量比的木犀草素與4，4'-聯(lián)吡啶及不同反應溶劑為主要影響因素，探索并確定相應合成條件：木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶以1∶3的物質量比混合后溶于7.0 mL丙酮溶劑，25℃下攪拌3 h后，于室溫下?lián)]發(fā)，5 d后得到黃褐色粉末狀晶體。結果表明，在極性相對較小的溶劑體系中，反應物分子間形成數(shù)目合適且方向飽和的氫鍵連接，可有效促進藥物共晶生成。

木犀草素；4，4'-聯(lián)吡啶；藥物共晶；溶液揮發(fā)法

網(wǎng)絡出版時間2015-12-25 13:10:48[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151225.1310.034.html

張羽男,殷和美,張宇,等.以4，4'-聯(lián)吡啶為配體的木犀草素藥物共晶的合成及表征[J].東北農業(yè)大學學報,2015,46(12):72-78.

Zhang Yunan,Yin Hemei,Zhang Yu,et al.Synthesis and characterization of Pharmaceutical Co-crystal of Luteolin with 4, 4'-Dipyridy[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(12):72-78.(in Chinese with English abstract)

藥物固體存在形態(tài)主要有多晶型、鹽、水合物或溶劑化物等。藥物研發(fā)過程需根據(jù)藥物性質及目標制劑要求選擇藥物固體形態(tài)。固體形態(tài)對藥物理化性質影響較大，如溶解度、溶出速率、引濕性及穩(wěn)定性等。近年來，藥物共晶技術作為一種新興技術在新型藥物及其新劑型的研發(fā)領域日益受到關注[1]。藥物共晶是指藥物活性分子（Active pharmaceutical ingredient，API）通過引入共晶形成物（Cocrystal former，CCF），按一定計量比在π-π鍵和氫鍵等分子間弱作用力下形成超分子晶體化合物，API和CCF在室溫下均為固體[2-4]。藥物共晶制備方法按組分形態(tài)分為兩類：溶液合成法和固體合成法。溶液合成法即合成時API和CCF均為液態(tài)，是目前最常用方法，包括溶液揮發(fā)法，冷卻結晶法等。溶液結晶法的前提是API和CCF在溶液中相互作用力強于API或CCF各自的相互作用力，才可能形成共晶。固態(tài)研磨法在機械作用力下使得藥物形成共晶，最早關于研磨法制備共晶的報道是1884年WOhler用kügelchen制備出醌和苯二酚的晶體。固態(tài)研磨法又分為無液研磨和加液共磨，以研磨過程中是否加入溶劑區(qū)分。共晶優(yōu)勢為主分子API可以是酸性分子、堿性分子或非離子化分子，且CCF選擇較廣泛，包括藥用輔料或其他藥物。藥物形成共晶后藥理作用不受影響，但理化性質得到改善，如提高生物利用度、改善穩(wěn)定性或改變熔點等[5-6]，同時對于專利保護的晶型藥物，可通過共晶制備新的固體形態(tài)，擴大專利保護范圍。當前，已有報道藥物共晶研究主要集中于CCF選擇及其與API空間超分子結合等方面，如可可堿、咖啡因和異煙酰胺作為CCF與槲皮素分別形成的藥物共晶，吡拉西坦作為CCF與楊梅素形成共晶等[7-8]，而對合成條件系統(tǒng)研究卻鮮有報道，無法有針對性地為后續(xù)工業(yè)化放大生產提供前期參考。因此，如何在已明確API和CCF前提下，系統(tǒng)探索相應藥物共晶合成條件極為重要。

木犀草素（Luteolin）是一種天然多羥基黃酮醇類化合物，化學名為3'，4'，5，7-四羥基黃酮，分子式為C15H10O6。主要存在于菊花、金銀花、忍冬花、白毛夏枯草等天然藥物，及百里香、芽甘藍、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜和胡蘿卜等蔬菜中，以糖苷形式分布于芹菜、青辣椒、紫蘇葉等多種植物中。木犀草素純品為黃色結晶狀粉末，作為一種廣泛分布于植物界的黃酮類化合物，具有抗菌、抗炎、保護心血管、止咳、祛痰、抗氧化和逆轉細菌耐藥性等多種藥理作用[9-13]。然而，由于木犀草素本身難溶于水，在生物體內生物利用度低且難以成藥[14]。將木犀草素制備成藥物共晶，將有可能利用難題。目前唯一報道的木犀草素藥物共晶是通過異煙酰胺為CCF與木犀草素形成的藥物共晶，未系統(tǒng)考慮API和CCF的物質量比或反應溶劑等因素對試驗的影響[6]。

本文通過選擇不同物質量比的木犀草素與4，4'-聯(lián)吡啶（4，4'-dipyridy）及不同反應溶劑，利用溶液揮發(fā)法首次制備得到木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶天然藥物共晶，確定相應合成條件。以期為木犀草素類天然藥物活性成分開發(fā)利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器

雙目解剖體式顯微鏡（鄂州市貝朗科技有限公司）；電子天平FA2004（上海恒平電子天平有限公司）；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；VERTEX 70傅立葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）；APEX II CCD單晶衍射儀（德國Bruker公司）；D8粉末X-射線衍射儀（德國Bruker公司）；AVANCE-III 600MHz型核磁共振儀（德國Bruker公司）；HP DSC1差示掃描量熱儀（瑞士METTLER TOLEDO公司）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2藥物

木犀草素購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3試劑

無水乙醇、丙酮、甲醇、4，4'-聯(lián)吡啶均購于天津市科密歐化學試劑有限公司（AR），異丙醇購于天津市凱通化學試劑有限公司（AR）。

1.2方法

1.2.1探索合成條件

經(jīng)文獻調研[15]和理論分析，選定乙醇和丙酮混合液、乙醇、丙酮、甲醇及異丙醇作反應溶劑，選定木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶的物質量比為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1和1∶4，試驗方案見表1。室溫下攪拌3 h后，緩慢揮發(fā)，得到產品后分析鑒定。

1.2.2試驗產物表征

1.2.2.1XRD測試

X-射線粉末衍射是一種定量、定性分析技術，可確定制劑中原料藥晶型狀態(tài)，即晶態(tài)、非晶態(tài)或二者共存。取等量木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶以及試驗合成樣品（約30 mg），研成細粉狀，測試條件為：Cu靶，電壓30 kV，電量40 mA，掃描速度10°·min-1，測試角度范圍在20～50°，室溫。

表1　木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶不同物質的量比及不同溶劑制備表Table 1Preparation table of luteolin and 4,4'-dipyridy in different molar ratios and different solvents

1.2.2.2差熱測試

差熱法是測定樣品與參比物熱量差（dQ/dT）與溫度關系的技術，通過測定物質熔點進行藥物及其制劑鑒別，測定藥品純度，同時區(qū)分藥物共晶的晶型。取等量木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶和試驗合成樣品分別置于坩堝內（約5mg），室溫下以10℃·min-1升溫至600℃，在氮氣保護條件下測試。

1.2.2.3紅外測試

紅外吸收光譜是根據(jù)分子內部原子間相對振動和分子轉動等信息確定被測物分子結構的分析方法。紅外光譜峰位、峰強及峰形可以判斷共晶化合物中可能存在的官能團，可推斷分子間可能存在的氫鍵等分子間作用力。分別取木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶及合成樣品（約10 mg），研細，用KBr壓片，相同條件下作紅外光譜對照試驗，測試波數(shù)范圍400～4 000 cm-1。

1.2.2.4核磁測試

核磁共振波譜可有效確定藥物共晶結構中氫原子和碳原子數(shù)目及化學環(huán)境，為分析API與CCF分子間作用力提供證據(jù)。分別取等量（約5 mg）木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶以及合成樣品溶于DMSO-d6溶劑中，TMS為內標，室溫下對以上樣品核磁共振譜測定。

2　結果與分析

2.1樣品合成

按表1列出的試驗方案試驗，先量取溶劑置于反應容器內，放置磁力攪拌器上攪拌，并稱取定量的木犀草素加入反應容器中，再稱取4，4'-聯(lián)吡啶投置于反應容器內，此時開始計時，在攪拌過程期間，注意避免光照。攪拌3 h后，將反應溶液過濾，留取濾液，放置避光處于室溫下緩慢蒸發(fā)。試驗結果顯微照片如圖1所示。由圖1可見，除C3試驗組外，其余試驗組產物中均含有淡黃色粉末狀和白色條狀透明的兩種晶體，推測可能是木犀草素晶體和4，4'-聯(lián)吡啶晶體的混合物。而C3試驗組則形成較為規(guī)則、均一的黃褐色粉狀晶體，推測可能是木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶的藥物共晶。C3試驗組合成條件為木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶的摩爾比1∶3，混合后溶于7.0 mL丙酮溶劑中，室溫下攪拌3 h后緩慢揮發(fā)，5 d后得到目標產物。

2.2XRD解析

木犀草素與4，4'-聯(lián)吡啶在不同計量比或不同溶劑條件下形成固體產物、木犀草素與4，4'-聯(lián)吡啶的物理混合譜圖和起始原料的XRD如圖2所示?？芍?，木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶的物理混合物特征峰位為（2θ）：20.4°、23.1°、24.5°、25.1°、26.2°、27.5°、29.7°、31.2°、32.0°、37.7°和39.4°，包含木犀草素純品譜圖和4，4'-聯(lián)吡啶純品譜圖，其峰位及峰型基本一致。木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶及兩者的物理混合譜圖與所有試驗組所得固體產物XRD衍射圖分別比對，A1特征峰位為（2θ）：20.4°、23.1°、24.5°、25.2°、26.3°、27.8°、29.9°、31.4°、32.5°、33.2°、37.8°和39.4°，與木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶的物理混合物峰位相近，峰型基本相同。所有試驗組所得產物的XRD圖譜與木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶的物理混合物XRD譜圖對比后發(fā)現(xiàn)，只有C3試驗組產物譜圖呈明顯不同，特征峰發(fā)生明顯改變，其峰位及峰型完全不同。C3試驗組產物特征峰位為（2θ）：20.5°、22.2°、24.1°、25.3°、27.3°、28.7°、30.4°、31.2°、31.7°、33.9°、37.0°和38.6°，C3試驗組產物在22.2°、28.7°、30.4°和33.9°處出現(xiàn)新的特征峰，原本歸屬為木犀草素的21.2°、25.9°、28.2°和4，4'-聯(lián)吡啶的22.8°特征峰消失，表明C3試驗組生成新的晶相。

圖1　試驗結果顯微照片F(xiàn)ig.1Microscope photos of experimental results

圖2　試驗結果產物XRD對比Fig.2Comparison of XRD of experimental products

2.3差熱解析

C3試驗組產物與起始原料的DSC表征結果見圖3，由圖3可知，木犀草素熔點為341℃，經(jīng)溶劑揮發(fā)法制備的C3試驗組產物熔化吸熱峰對應溫度不同于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶，其熔點介于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶之間，263和291℃處出現(xiàn)新的吸熱峰，原本歸屬為木犀草素的405℃的峰位及4，4'-聯(lián)吡啶的227和252℃峰消失，表明有新晶相的形成。C3試驗組產物在72、115和340℃的吸熱峰與原料藥相似，可能是含有未反應完全的原料藥所致。

圖3　木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶及C3試驗組產物的DSC圖Fig.3DSC of luteolin,4,4'-dipyridy and C3 products

2.4紅外解析

木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶和C3試驗組產物的紅外光譜圖如圖4所示。C3試驗組產物在3 773、3 310、3 214、3 150、2 917、2 834、1 735、1 626、1 585、1 514、1 444、808、732、620和559 cm-1等處有吸收峰，其中位于1 364 cm-1的吸收峰與4，4'-聯(lián)吡啶的紅外光譜ν（-CN）峰相似；位于3 310和1 735 cm-1處吸收峰與山奈酚紅外光譜ν（-OH）、ν（-C=O）相似，峰位有所偏移，可能是木犀草素的-OH和4，4'-聯(lián)吡啶中兩端的N原子形成氫鍵所致；C3試驗組產物位于1 585、1 514和1 444 cm-1處吸收峰歸屬為ν（C=C），位于3 214和3 150 cm-1峰歸屬為ν（-CH），位于620、732和808 cm-1處吸收峰歸屬為芳香環(huán)上δ（Ar-H）。說明C3試驗組產物中含有木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶。由紅外吸收光譜分析可知，木犀草素與4，4'-聯(lián)吡啶之間可能由于C=N…H-O或C=O…H-O的相互作用，形成共晶化合物。

圖4　木犀草素、4，4'-聯(lián)吡啶和C3試驗組產物紅外光譜Fig.4IRspectrasofluteolin,4,4'-dipyridyand C3products

2.5核磁解析

如圖5所示，C3試驗組產物的1H-NMR（400M，DMSO）δC（ppm）12.49（1H，s，5-OH），10.77（1H，s，7-OH），9.57（1H，s，4'-OH），9.44（1H，s，3'-OH），7.68（1H，d，J=2.6 Hz，2'-H），7.51（2H，dd，J=8.5 Hz，2.6 Hz，6'-H），6.87（1H，d，J=8.5 Hz，5'-H），6.39（1H，d，J= 2.4 Hz，8-H），6.17（1H，d，J=2.4 Hz，6-H）和6.07（1H，s，3-H）歸屬為木犀草素特征峰；8.72（4H，dd，J=5.4 Hz，1.8 Hz）和7.81（4H，dd，J= 5.4 Hz，1.8 Hz）是4，4'-聯(lián)吡啶上鄰位氫和間位氫的化學位移特征信號。

圖5　C3試驗組產物的1H-NMRFig.51H-NMR of C3 products

C3試驗組產物的13C-NMR的δC（ppm）見圖6。175.9（C=O）、165.5（C-7）、164.0（C-2）、160.7（C-5）、156.8（C-9）、147.6（C-4'）、146.9（C-3'）、121.9（C-1'）、119.8（C-6'）、115.6（C-5'）、115.21（C-2'）、104.4（C-10）、102.9（C-3）、98.1（C-6）和93.2（C-8）歸屬為木犀草素特征峰；121.2、144.3和150.5為4，4'-聯(lián)吡啶芳基碳的特征信號。表明C3試驗組產物中存在有木犀草素分子和4，4'-聯(lián)吡啶分子。

圖6　C3試驗組產物的13C-NMRFig.613C-NMR of C3 products

3　討論

藥物共晶作為一種改善藥物性質的有效手段，具有廣泛應用前景，深受研究者青睞。本文在木犀草素的藥物共晶制備時選用甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇及乙醇與丙酮的混合液5種極性不同的溶劑體系。反應產物經(jīng)顯微鏡分析，只有反應溶劑為丙酮時，所得產物不同于其他試驗組，形成較為規(guī)則均一的黃褐色粉狀晶體，而其他4組溶劑作為反應溶劑時得到的均是淡黃色粉末狀木犀草素晶體和白色條狀透明4，4'-聯(lián)吡啶晶體的混合物。可能是因為甲醇、乙醇和異丙醇溶劑極性大于丙酮，且均含有-OH，易與木犀草素的-C=O或4，4'-聯(lián)吡啶兩端N原子形成氫鍵，而不利于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶分子間氫鍵形成導致原料析出，難以形成藥物共晶產物。而丙酮溶劑相對于上述其他溶劑，極性較小有利于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶分子間氫鍵形成而促進藥物共晶，待后續(xù)研究深入分析。

經(jīng)顯微照片分析，C3試驗組產物不同于其他試驗組產物。對所有試驗產物進行XRD測試，除C3試驗組產物不同于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶物理混合物，其余均與之相似。為進一步驗證C3試驗組產物為目標產物進行DSC測試，差熱分析結果顯示，C3試驗組產物熔化吸熱峰對應的溫度不同于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶，熔點介于木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶之間。由紅外分析結果可知，木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶譜圖中可見原料藥特征吸收峰，幾處峰位發(fā)生偏移，因木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶分之間形成氫鍵，繼而形成共晶。

當木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶的摩爾比為1∶3時合成木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶的藥物共晶?？赡苁怯捎?個木犀草素分子含有4個-OH和1個-C=O，一個4，4'-聯(lián)吡啶分子兩端各有1個N原子。藥物共晶分子自組裝過程中，氫鍵為主要的分子驅動力與結合力，當木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶的物質量比為1∶3時，木犀草素分子上的多個-OH和-C=O恰好可與4，4'-聯(lián)吡啶分子兩端的N原子達到數(shù)目合適且方向飽和的氫鍵連接，從而可形成長程有序的藥物共晶。

本試驗采用溶劑揮發(fā)法首次制備得到新木犀草素-4，4'-聯(lián)吡啶天然藥物共晶，確定合成條件為木犀草素和4，4'-聯(lián)吡啶的物質量比1∶3，混合后溶于7.0 mL的丙酮溶劑，室溫下攪拌3 h后緩慢揮發(fā)，反應時間為5 d。

4　結論

本文采用溶劑揮發(fā)法，以4，4'-聯(lián)吡啶為共晶配體與木犀草素藥物活性分子合成未見報道的新型藥物共晶，并進行相應結構表征和性質分析。初步探討API和CCF物質的量比及反應溶劑等因素對藥物共晶制備結果影響，確定相應制備方法和合成條件。理論分析表明，在極性相對較小的溶劑體系中，API和CCF分子間形成數(shù)目合適且方向飽和的氫鍵連接，可有效促進藥物共晶生成。為后續(xù)木犀草素類天然藥物活性成分開發(fā)利用及臨床前成藥研究提供新途徑。

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SynthesisandcharacterizationofPharmaceuticalCo-crystalof Luteolin with 4,4'-Dipyridy

ZHANG Yunan1,YIN Hemei1,ZHANG Yu1,ZHAO Wei1,LIU
Lixin1,ZHANG Dajun1,KUANG Haixue2(1.Institute of Pharmacy in Heilongjiang Province,Jiamusi University,Jiamusi Heilongjiang 154007,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040,China)

A new pharmaceutical co-crystal of Luteolin with 4,4'-dipyridy was firstly synthesized by solution evaporation method.The powder of luteolin-4,4'-dipyridy had been characterized by IR, NMR,XRD and DSC.By selecting different molar ratios of Luteolin and 4,4'-dipyridy and different reaction solvents as the main factors,the preparation condition was to be explored and to be obtained. Luteolin and 4,4'-bipyridy were combined in 7.0 mL acetone with stirring at 25℃for 3 h,and their molar ration was 1∶3.The resulting solution was filtered and allowed to evaporate slowly at room temperature.Then tan powdery crystals were obtained after 5 days.As results,it showed that hydrogen bonds with proper numbers and saturated direction between molecular could promote the formation of pharmaceutical co-crystals in solovent with weak polarity.

luteolin;4,4'-dipyridy;pharmaceutical co-crystal;solution evaporation method

R194

A

1005-9369（2015）12-0072-07

2015-10-17

中國博士后科學基金資助項目（2014M561382）；佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目（LM2015_094）；佳木斯大學創(chuàng)新團隊項目（CXTD-2013-05）

張羽男（1979-），男，副教授，博士，碩士生導師，研究方向為天然藥物共晶的制備。E-mail:zhangyunan79@163.com

匡海學，教授，博士生導師，研究方向為中藥藥效物質基礎。E-mail:hxkuang1954@hotmail.com