佘曉東高 盈張莉莉沈永年Li Dongmei，2?劉維達(dá)?

·論著·

白念珠菌線粒體功能缺陷對(duì)胞壁結(jié)構(gòu)及毒力的影響

佘曉東1高 盈1張莉莉1沈永年1Li Dongmei1，2?劉維達(dá)1?

目的: 明確白念珠菌線粒體功能缺陷對(duì)菌株細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及致病力的影響。方法: 通過透射電鏡觀察野生株與缺陷株胞壁結(jié)構(gòu)的差異；利用qPCR檢測(cè)野生株與缺陷株細(xì)胞壁成分MNN4、PHR3，常見黏附因子ALS1、ALS3及毒力因子SAP9、SAP10的表達(dá)；利用小鼠系統(tǒng)感染模型明確缺陷株與野生株在小鼠致死率及臟器菌載量等方面的差異。結(jié)果: 與野生株相比，透射電鏡顯示缺陷株細(xì)胞壁整體結(jié)構(gòu)較為疏松，胞壁較薄，胞壁內(nèi)外膜境界模糊；qPCR顯示缺陷株細(xì)胞壁成分、黏附因子、毒力因子表達(dá)顯著降低；動(dòng)物模型顯示缺陷株無法導(dǎo)致小鼠系統(tǒng)性感染死亡，肝、脾、腎臟器菌載量在接種后第3日明顯降低。結(jié)論: 白念珠菌線粒體功能缺陷會(huì)導(dǎo)致其胞壁完整性，并下調(diào)主要胞壁成分及毒力因子的表達(dá)，從而導(dǎo)致菌株致病力顯著減弱。

白念珠菌； 線粒體； 細(xì)胞壁； 毒力

白念珠菌(Candida albicans)屬于重要的條件致病性真菌，1除宿主機(jī)體免疫力降低等致病因素之外，獨(dú)特的胞壁結(jié)構(gòu)及毒力因子是其致病的重要因素。白念珠菌線粒體作為菌體能量代謝的重要細(xì)胞器，2其功能缺陷勢(shì)必會(huì)引起菌株自身代謝改變并影響菌株活性，本實(shí)驗(yàn)擬通過研究白念珠菌線粒體功能缺陷時(shí)其胞壁形態(tài)、成分及毒力的改變，初步明確線粒體功能變化對(duì)白念珠菌致病性的影響，以期進(jìn)一步了解菌株自身代謝與其致病能力的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 念珠菌培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)菌株(SC5314，由中國微生物菌種保藏中心提供)，線粒體功能缺陷株(GOA31，由美國Georgetown University微生物免疫中心惠贈(zèng))。菌株于沙堡弱氏固體培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前挑單個(gè)培養(yǎng)菌落接種于3 mL YPD(0.5%酵母浸膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖)液體培養(yǎng)基中37℃恒溫?fù)u床孵育48 h備于實(shí)驗(yàn)。

1.2 白念珠菌透射電子顯微鏡掃描 將YPD液體中

念珠菌離心(3000 r/min，5 min)后用PBS緩沖液清洗3遍，放置于2.5%戊二醛中4℃過夜保存，標(biāo)本經(jīng)脫水、包埋、超薄切片、重金屬染色后于透射電子顯微鏡(HITACHI－H7650)下觀察胞壁結(jié)構(gòu)及形態(tài)變化。

1.3 白念珠菌總RNA提取 念珠菌RNA采用液氮研磨后參照Trizol產(chǎn)品說明書(Life Technologies)用酚、氯仿、異戊醇進(jìn)行提取經(jīng) DNase消化殘存的DNA。提取的RNA經(jīng)Nano drop測(cè)定濃度后檢測(cè)樣品濃度以及A260/A280(1.8～2.1)，然后于2%瓊脂糖凝膠80V電泳檢測(cè)提取質(zhì)量，將質(zhì)量合格的RNA－80℃保存。

1.4 熒光定量PCR 選取內(nèi)參C.albicans 18S RNA和胞壁成分因子MNN4、PHR3以及黏附和毒力因子ALS1、ALS3、SAP9、SAP10進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。選用IDT DNA在線軟件設(shè)計(jì)引物(見表1)。反應(yīng)體系:2×SYBR Green PCR buffer 12.5 μL、ROX 0.5 μL、primer(5 pmol)1 μL、Template＋ddH2O 11 μL，總體積25 μL；95℃，2 min，接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95℃，15 s；59℃，1 min。依據(jù)2－△△CT法判讀結(jié)果。

表1 qPCR擴(kuò)增引物序列

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用雌性Balb/C純系小鼠，6～7周齡，揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。用無菌生理鹽水洗滌白念珠菌，重復(fù)3次，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果將白念珠菌細(xì)胞調(diào)節(jié)到1×106個(gè)/mL，通過尾靜脈注射白念珠菌懸浮液。實(shí)驗(yàn)小鼠分為野生株(SC5314)感染模型，缺陷株(GOA31)感染模型。每組13只小鼠，觀察21 d，記錄每天小鼠存活數(shù)量。分別于菌株接種1、2、3 d后每組取1只小鼠處死取肝、脾、腎組織研磨稀釋后于YPD培養(yǎng)基中37℃恒溫?fù)u床孵育48 h進(jìn)行菌落(Colony Forming Units，CFU)計(jì)數(shù)(每個(gè)臟器組織做3次涂板計(jì)數(shù)，取均數(shù))。并取接種2 d后腎臟組織進(jìn)行病理取材和染色制片，觀察真菌侵入程度。

2 結(jié)果

2.1 白念珠菌透射電鏡掃描 鏡下結(jié)構(gòu)顯示野生株(圖1A)細(xì)胞壁整體結(jié)構(gòu)較為完整，胞壁較厚且均勻致密，胞壁內(nèi)外膜境界清晰。缺陷株(圖1B)則表現(xiàn)為胞壁較薄、疏松，胞壁內(nèi)外膜境界較模糊，尤以內(nèi)側(cè)膜破壞較重，甚至部分缺失。

圖1 白念珠菌野生株(A)與缺陷株(B)透射電鏡掃描圖(×25k)

2.2 qPCR測(cè)定白念珠菌細(xì)胞壁成分及毒力因子變化 熒光定量PCR結(jié)果顯示，缺陷株各檢測(cè)因子的Ct(Cycle threshold)值較野生株顯著改變，從柱狀圖可以看出，缺陷株較野生株的胞壁成分基因及毒力基因表達(dá)整體下調(diào)(圖2)，下調(diào)倍數(shù)為2.4～5.8，其中以PHR3和ALS3表達(dá)差異最大。

圖2 野生株與缺陷株細(xì)胞壁成分因子和菌株毒力因子分布

2.3 小鼠系統(tǒng)性感染模型驗(yàn)證菌株毒力變化 野生株接種組小鼠全部于接種后5天內(nèi)死亡，其中接種后第2天死亡4只，其余均在3～5天內(nèi)死亡(1～2只/天)；缺陷株接種組未見小鼠死亡(圖3)。兩組小鼠各臟器菌載量結(jié)果顯示，腎臟組織菌載量最多，肝臟次之、脾臟最少，野生株接種組菌載量顯著高于缺陷株接種組。缺陷株接種組各臟器菌載量在第2天最高，第3天顯著降低，野生株接種組未見明顯降低(表2)。野生株接種后2天腎臟組織病理示組織內(nèi)大量菌絲形成，部分菌絲成團(tuán)并嵌入組織內(nèi)部(圖4A)，缺陷株感染組未見菌絲形成(圖4B)。

圖3 野生株與缺陷株白念珠菌接種小鼠21天存活率

圖4 小鼠尾靜脈接種野生株(A)及缺陷株(B)后第2天腎臟組織病理切片圖(PAS，×100)

表2 小鼠尾靜脈接種白念珠菌后不同臟器CFU計(jì)數(shù)

3 討論

線粒體是一種存在于真核細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所。因此，線粒體功能變化會(huì)從源頭上影響整個(gè)細(xì)胞的能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)合成。本實(shí)驗(yàn)利用線粒體功能缺陷白念珠菌GOA31，對(duì)線粒體功能缺陷條件下菌株細(xì)胞壁成分合成及毒力因子等關(guān)鍵致病因素的變化進(jìn)行了驗(yàn)證。

白念珠菌細(xì)胞形態(tài)的變化是其自身狀態(tài)的直接體現(xiàn)，其中細(xì)胞壁作為白念珠菌和宿主的分界面，參與白念珠菌的黏附，分泌致病性的毒力因子，在引起侵襲性感染的同時(shí)還可以通過相應(yīng)的受體和配體的結(jié)合來誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答。白念珠菌細(xì)胞壁主要包括甘露聚糖、β－葡聚糖及幾丁質(zhì)。其中β－葡聚糖和幾丁質(zhì)是細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)成分，甘露聚糖是白念珠菌細(xì)胞壁可溶性的具有免疫顯性作用物質(zhì)。3本實(shí)驗(yàn)電鏡結(jié)果顯示缺陷株較野生株在細(xì)胞壁完整性方面有明顯區(qū)別，估計(jì)與線粒體功能的缺陷影響自身營養(yǎng)物質(zhì)合成繼而影響胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中為進(jìn)一步明確此推測(cè)，我們選取白念珠菌細(xì)胞壁中兩種最關(guān)鍵的成分甘露聚糖及葡聚糖的代表基因進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，結(jié)果顯示上述兩種成分均出現(xiàn)明顯表達(dá)下降，與電鏡結(jié)果相互應(yīng)證，更加肯定了線粒體功能變化對(duì)白念珠菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的影響。

白念珠菌致病時(shí)首先黏附宿主細(xì)胞，然后通過各種細(xì)胞外酶增強(qiáng)毒力侵入宿主形成感染灶。凝集素樣序列(Agglutinin－Like Sequence，ALS)和分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secreted Aspartyl Proteinase，SAP)作為目前已知重要的白念珠菌黏附及毒力因子，在其致病過程中起到關(guān)鍵作用。其中ALS1在血行播散性鼠感染模型中是重要的毒力因子。4ALS3除了其黏附作用，還作為重要的抗原識(shí)別位點(diǎn)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞對(duì)白念珠菌的吞噬，是引起上皮細(xì)胞損傷和后續(xù)細(xì)胞毒作用的關(guān)鍵一步。5在SAP家族中，SAP9和SAP10對(duì)維持白念珠菌表面完整性至關(guān)重要，在白念珠菌感染患者和攜帶者中均高表達(dá)。6SAP9參與白念珠菌芽管形成，不僅是白念珠菌入侵宿主的毒力因子，也是宿主識(shí)別白念珠菌，活化抗感染免疫的誘導(dǎo)因子。7為進(jìn)一步研究線粒體功能缺陷對(duì)菌株毒力的影響，我們通過熒光定量PCR檢測(cè)了上述4個(gè)重要黏附及毒力因子在線粒體缺陷株的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上述因子在缺陷株表達(dá)均明顯降低。說明缺陷株在黏附力及侵襲性方面均明顯減弱，可能對(duì)其侵襲宿主及免疫逃逸造成影響。

動(dòng)物模型可以模擬、反映真實(shí)的機(jī)體致病狀態(tài)，有助于更方便，更有效地認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。8本實(shí)驗(yàn)選用系統(tǒng)性感染小鼠模型為研究對(duì)象，直觀研究缺陷株對(duì)小鼠致病力的改變。結(jié)果顯示，缺陷株較野生株毒力明顯減輕，可能與上述黏附因子及毒力因子表達(dá)下降有關(guān)。為進(jìn)一步觀察致病菌在小鼠體內(nèi)的感染情況，我們對(duì)各感染小鼠的肝、脾、腎進(jìn)行菌載量測(cè)定及腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果在感染的各臟器中，腎臟組織菌載量最高、肝臟次之、脾臟最少，這與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。9分析原因，估計(jì)與各臟器的形態(tài)結(jié)構(gòu)、血流狀況及免疫反應(yīng)對(duì)念珠菌感染造成的影響不同有關(guān)。缺陷株接種小鼠各臟器菌載量在感染后第2天達(dá)到高峰，之后明顯減少，而野生株組則未見明顯變化。腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)顯示，相對(duì)于野生株在腎臟組織內(nèi)大量菌絲形成并嵌入組織，缺陷株未見明顯菌絲形成。說明缺陷株在進(jìn)入小鼠體內(nèi)后并沒有形成致病性的菌絲相，經(jīng)過短暫自身繁殖增長后，由于黏附力及毒力的降低逐漸被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，因而無法形成系統(tǒng)性感染。但本次實(shí)驗(yàn)我們只進(jìn)行了初步研究，觀察時(shí)間較短，只檢測(cè)了通常認(rèn)為感染最嚴(yán)重時(shí)期即接種后3天之內(nèi)的臟器真菌載量，未能完全研究出致病菌株特別是缺陷株在小鼠體內(nèi)的感染及清除過程；且動(dòng)物數(shù)量較少，不能完全排除小鼠個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量、延長菌載量觀察時(shí)間，進(jìn)一步明確整個(gè)感染過程。

本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)及動(dòng)物模型方法從細(xì)胞形態(tài)、菌株毒力及致病力方面驗(yàn)證了線粒體功能缺陷對(duì)白念珠菌致病性的影響，初步明確了菌株線粒體功能缺陷會(huì)導(dǎo)致自身致病力降低，對(duì)今后念珠菌感染性疾病控制及抗真菌新藥的研發(fā)具有一定意義。

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(收稿:2015－01－26)

Effects of Candida albicans mitochondrial dysfunction on cell wall structure and virulence

SHE Xiao-dong，GAO Ying，ZHANG Li-li，et al.Institute of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)，Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs，Nanjing，210042

Objective:To determine the effects of Candida albicans mitochondrial dysfunction on cell wall structure，virulence and pathogenicity.Methods:The differences of cell wall structure between the wild－type strain and the deficient strain were observed under transmission electron microscopy.The expression of cell wall components MNN4，PHR3，adhesion factors ALS1，ALS3 and virulence factors SAP9，SAP10 in the wild－type and deficient strain were detected using qPCR.The differences of the fatality rate and organ CFU load between the wild－type and deficient strain were detected in mice system infection model.Results:Compared with the wild－type strain，the deficient strain showed that the cell wall was thinner，the structure was looser and the realm of inner and outer membrane of cell wall was fuzzier under transmission scanning electron microscope.The expression of cell wall components，adhesion factors and virulence factors reduced significantly and there was no mice death in the deficient strain group.The CFU in liver，spleen and kidney of the mice treated with the deficient strain after 3 days reduced significantly.Conclusion:Mitochondrial dysfunction in candida albicans damage the cell wall integrity，reduce the expression of the major cell wall components and virulence factors，resulting in reduction of the pathogenicity of strain.

Candida albicans；mitochondrial；cell wall；virulence

國家自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(編號(hào):81401652)江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(編號(hào):BK20130063)

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，江蘇省皮膚病與性病重點(diǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京，210042 2 Department of Microbiology＆Immunology，Georgetown University Medical Center，Washington DC 20057，USA

?通信作者