重組大腸埃希菌外膜蛋白C的表達(dá)、純化及多克隆抗體制備

俱雄1，陳春琳1，劉祥1，王成祥2，王令1，吳三橋1，張濤1

(1.陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中723000；

2. 安徽省肥西縣特殊教育學(xué)校， 安徽 合肥 231200)

[摘要]采用分子克隆方法獲得大腸埃希菌外膜蛋白OmpC表達(dá)菌株；利用SDS-PAGE電泳切膠純化、尿素梯度復(fù)性獲得OmpC蛋白，免疫小鼠制備OmpC蛋白多克隆抗體。ELISA法證實(shí)OmpC抗血清滴度達(dá)1∶6 400倍，Western blotting發(fā)現(xiàn)OmpC抗血清具有很好的特異性。通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)OmpC序列同源性分析顯示不同細(xì)菌間存在較高同源性，采用MEGA軟件對(duì)OmpC的系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)腸道致病菌親緣關(guān)系更近。為OmpC蛋白免疫學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]OmpC蛋白；酶聯(lián)試驗(yàn)；多克隆抗體；Western blotting

[文章編號(hào)]1673-2944(2015)03-0052-06

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q789

收稿日期：2015-01-16

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0723)；陜西理工學(xué)院博士科研啟動(dòng)項(xiàng)目(SLGQD13-15)

作者簡(jiǎn)介：俱雄(1990—)，男，陜西省咸陽(yáng)市人，陜西理工學(xué)院碩士研究生，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)；[通信作者] 劉祥(1983—)，男，安徽省合肥市人，陜西理工學(xué)院講師，碩士生導(dǎo)師，博士，主要研究方向?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)。

大腸埃希菌(Escherichiacoli)在自然界中廣泛存在，依據(jù)其致病作用，分為產(chǎn)腸毒素、腸出血性、腸致病性、腸侵襲性、產(chǎn)志賀毒素和尿道致病性等[1]，是一種人畜共患病[2],可引起食物中毒[3]、尿道感染[41]、腹瀉[5]以及兒童腦膜炎[6]等疾病。而其誘發(fā)的奶牛乳房炎發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給奶制品生產(chǎn)及品質(zhì)帶來(lái)重大影響[7-8]。OmpC(outer membrane protein C)蛋白為大腸埃希菌主要外膜蛋白之一，是具有三聚體結(jié)構(gòu)的非特異性孔道蛋白[9]，其合成受ompB3基因調(diào)控，基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)通過(guò)EnvZ-OmpR雙組分監(jiān)管系統(tǒng)的介導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)OmpC與細(xì)菌的抗生素耐藥性有關(guān)，缺失OmpC使細(xì)菌外膜封閉，降低膜通透性，耐藥性增加[11-13]；OmpC也是大腸埃希菌侵染動(dòng)物體的重要毒力蛋白之一[14]，并具有很好的免疫原性，能加快巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的提呈作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫[15]，對(duì)不同血清型分離株具有交叉保護(hù)作用[16]。因而，OmpC可提高宿主免疫能力，在疫苗上有較好的應(yīng)用前景[17]。

本試驗(yàn)利用分子克隆方法獲得大腸埃希菌OmpC表達(dá)菌株；純化OmpC蛋白，免疫小鼠，制備并鑒定獲得的多克隆抗體。為OmpC蛋白功能與疫苗開(kāi)發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

E.coliK12菌株，E.coliDH5a菌株，E.coliBL21菌株，pET-28a質(zhì)粒均由本院生物化學(xué)分子試驗(yàn)室保存。Taq酶、T4-DNA 連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、Protein Marker，以及DNAMarker均為大連寶生物公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母粉，IPTG、以及瓊脂糖購(gòu)于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒為西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒為上海生物工程公司；山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)于Sigma公司；引物合成、基因序列測(cè)定均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.2.2　重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)

將OmpC蛋白表達(dá)菌株過(guò)夜培養(yǎng)，以1∶100倍轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600約0.6時(shí)，加入終濃度0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，收集1 mL菌體，加入300 μL蛋白上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)OmpC蛋白表達(dá)情況。

1.2.3　重組蛋白的純化

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大量培養(yǎng)的OmpC菌株，經(jīng)過(guò)超聲破碎后，獲得的OmpC蛋白不溶于蛋白溶解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0)，表明OmpC蛋白表達(dá)后主要形成包涵體，可采用包涵體洗滌并結(jié)合SDS-PAGE蛋白電泳切膠的方法純化OmpC比較合適，主要步驟為：大量培養(yǎng)獲得OmpC表達(dá)菌株，加入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液超聲破碎，沉淀用包涵體洗滌液(含0.05% Triton X-100的Tris-HCl溶液)洗滌后，將包涵體溶解于8 mol/L尿素溶液中；進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，切下目的條帶，研缽中研磨后加入蛋白浸提液(含0.1% SDS的Tris-HCl溶液)，4 ℃浸提過(guò)夜，離心收集上清，加入體積比1∶4的丙酮沉淀蛋白，離心除去丙酮后加入50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)的蛋白溶解液，最后取適量溶液電泳檢測(cè)蛋白的純度與濃度。

1.2.4　重組蛋白的復(fù)性

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳切膠純化獲得的OmpC蛋白缺乏生物學(xué)活性，采用尿素濃度梯度的方法復(fù)性蛋白，主要步驟為：將純化的OmpC蛋白溶解于8 mol/L尿素溶液，置透析袋中，再將其放入含6 mol/L尿素的50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中，4 ℃放置4 h；接著依次為4 mol/L、2 mol/L、1 mol/L、0.5 mol/L尿素，最后置于50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中，4 ℃放置4 h；然后離心取上清溶液，取2 μL溶液進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。

1.2.5　重組蛋白小鼠多克隆抗體的制備

選取5周齡的雄性昆明鼠6只，免疫純化的OmpC蛋白50 μg/只。首次免疫采用弗氏完全佐劑，之后均采用弗氏不完全佐劑。首次免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫，7 d后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫。第3次免疫7 d后，小鼠眼球取血的方法獲得血清，置于4 ℃冰箱中過(guò)夜析出，離心取上清，最后將血清保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.6　ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)

通過(guò)ELISA酶聯(lián)法檢測(cè)抗血清效價(jià)[18]，主要步驟為：將復(fù)性的OmpC蛋白溶解至0.05 μg/μL，于對(duì)應(yīng)的96孔板中加入100 μL，37 ℃ 作用1 h，排空液體，加入200 μL封閉液，37 ℃ 孵育2 h，然后每孔加100 μL不同稀釋度的多抗血清，37 ℃孵育30 min；洗滌后加入100 μL二抗，37 ℃孵育30 min；加入50 μL底物A(雙氧水)與50 μL底物B(TMB)的混合液，37 ℃避光顯色10 min，最后加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

1.2.7　Western blotting法檢測(cè)抗體特異性

Western blotting顯色方法檢測(cè)小鼠OmpC抗血清特異性[19]。為消除pET-28a質(zhì)粒上自帶的His-標(biāo)簽蛋白所產(chǎn)生抗體的影響，采用E.coliK12 中OmpC蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)。主要步驟為：收集培養(yǎng)的E.coliK12菌株，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中煮樣5 min，上樣10 μL 進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)NC膜，加入多克隆抗血清(對(duì)照加入陰性抗血清)，37 ℃ 作用30 min，洗滌后，加入二抗血清37 ℃作用30 min，洗滌后DAB顯色，確定OmpC抗血清的特異性。

1.2.8　OmpC蛋白序列系統(tǒng)發(fā)生分析

根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)公布的細(xì)菌OmpC蛋白氨基酸序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析；通過(guò)MEGA5.02 軟件，并結(jié)合Neighbour-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)[18]。

2　結(jié)果和分析

2.1　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以E.coliK12基因組為模板，PCR擴(kuò)增ompC基因。獲得約1 000 bp的基因片段，與目的基因大小一致(如圖1(A1)，其中1為ompC基因)。將ompC-pET28a重組質(zhì)粒雙酶切檢測(cè)獲得約1 000 bp片段，與目的基因大小一致(圖1(A2)，其中1為ompC重組質(zhì)粒；2為ompC重組質(zhì)粒BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切)。此外，重組基因的測(cè)序結(jié)果顯示與NCBI公布的基因序列一致。

2.2　重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與蛋白純化

將OmpC表達(dá)菌株經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳獲得約40 kDa的蛋白條帶，重組蛋白表達(dá)大小情況與預(yù)期一致；并利用SDS-PAGE蛋白電泳切膠與尿素濃度梯度復(fù)性獲得純化的OmpC蛋白，如圖2所示(其中M為蛋白 marker；1為未誘導(dǎo)菌株；2為IPTG誘導(dǎo)菌株；3為純化的OmpC蛋白)。

圖1　大腸埃希菌ompC基因重組質(zhì)粒構(gòu)建　　　　　圖2　OmpC蛋白表達(dá)與純化

2.3　OmpC蛋白的小鼠抗血清效價(jià)檢測(cè)

將復(fù)性純化的OmpC蛋白免疫小鼠，獲得的多克隆血清經(jīng)ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)OmpC抗體在1∶6 400倍稀釋時(shí)，OmpC血清顯示的OD450值是陰性血清的2.1倍以上，表明OmpC抗體效價(jià)達(dá)到1∶6 400倍(圖 3)。

2.4　OmpC蛋白小鼠抗血清的特異性檢測(cè)

將小鼠抗血清以1∶3 200倍稀釋。利用Western blotting顯色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)E.coli與不同稀釋度的OmpC抗血清作用后有蛋白條帶顯現(xiàn)，而對(duì)照組未出現(xiàn)。表明OmpC小鼠多克隆抗體特異性較好。

2.5OmpC蛋白的氨基酸序列分析

利用DNAMAN軟件，選取NCBI公布的9種細(xì)菌OmpC蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除去抗壞血酸克呂沃爾菌(Kluyveraascorbata)，其它細(xì)菌表現(xiàn)出很高的同源性(圖4)。采用MEGA軟件構(gòu)建的OmpC系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示腸道致病菌：如福氏痢疾桿菌(Shigellaflexneri)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，鮑氏志賀菌(Shigellaboydii)，相對(duì)于其它細(xì)菌，具有更近的親緣關(guān)系(圖5)。

3討論

圖3　OmpC多克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)

OmpC具有很好的免疫原性，可提高機(jī)體的免疫能力[15-16]。動(dòng)物免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OmpC產(chǎn)生的抗體可增強(qiáng)小鼠、魚(yú)類(lèi)對(duì)病菌的抵抗力[20]?？梢?jiàn)，在疫苗的研制上，OmpC蛋白具有很好的開(kāi)發(fā)前景。因而，需要對(duì)OmpC免疫學(xué)功能進(jìn)行研究，而研究免疫學(xué)功能就必須要獲得OmpC抗血清。多克隆抗體以其制備方法簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，得到廣泛運(yùn)用[18]。目前，使用原核表達(dá)蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體仍是最常見(jiàn)的手段之一[21]。

本試驗(yàn)利用分子方法獲得OmpC原核表達(dá)載體，復(fù)性純化OmpC蛋白，并成功制備與鑒定OmpC多克隆抗體。但結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpC多克隆抗體效價(jià)偏低，這可能是鼠抗的原因。因而，試驗(yàn)中采用多只小鼠免疫OmpC蛋白獲得更多的抗血清，彌補(bǔ)效價(jià)低的不足。這為進(jìn)一步研究OmpC蛋白免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

圖4　OmpC蛋白氨基酸序列的多重比對(duì)

圖5　MEGA軟件構(gòu)建的OmpC氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化

OmpC作為革蘭陰性菌主要的外膜蛋白之一，具有重要的生物學(xué)功能，在遺傳進(jìn)化上存在相對(duì)保守性。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)不同細(xì)菌OmpC蛋白氨基酸序列的同源性分析證實(shí)，不同細(xì)菌的氨基酸序列具有較高的同源性；OmpC系統(tǒng)進(jìn)化研究顯示，腸道致病菌具有更近的親緣關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)為OmpC蛋白的交叉免疫保護(hù)作用研究提供依據(jù)。因而，可結(jié)合后續(xù)的免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)，為開(kāi)發(fā)廣譜抑菌的OmpC蛋白疫苗制劑奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]VOSTRIKOVA O P,ISAEVA M P,LIKHATSKAYA G N,et al.OmpC-like porin from outer membrane ofYersiniaenterocolitica: molecular structure and functional activity [J].Biochemistry,2013,78(5): 496-504.

[2]HUSSRIN A H,GHANEM I A,EID A A,et al.Molecular and phenotypic characterization ofEscherichiacoliisolated from broiler chicken flocks in Egypt [J].Avian Dis Avian,2013,57(3):602-611.

[3]RAWA S V,SARREAL C Z,MANDRELL R E.Strain Differences in Fitness ofEscherichiacoliO157:H7 to Resist Protozoan Predation and Survival in Soil[J].PloS One,2014,9(7):e102412.

[4]OBAID J M,MANSOUR S R,ELSHAHEDY M S,et al.UropathogenicEscherichiacoliisolates with different virulence genes content exhibit similar pathologic influence on Vero cells[J].Pol J Microbiol,2014,63(1):43-49.

[5]PREMJANI V,TILLEY D,GRUENHEID S,et al.EnterohemorrhagicEscherichiacoliOmpT regulates outer memb biogenesis[J].FEMS Microbiol Lett,2014,355(2):185-192.

[6]WAN L,GUO Y,HUI C Y,et al.The surface protease ompT serves asEscherichiacoliK1 adhesin in binding to human brain micro vascular endothelial cells [J].Pak J Pharm Sci,2014,27(3):617-624.

[7]余婷,安慧慧,吳聰明,等.奶牛乳房炎分離大腸桿菌的耐藥性及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2013,49(9):6-11.

[8]徐繼英,劉俊林,李先波,等.我國(guó)部分地區(qū)奶牛乳房炎源大腸桿菌生物學(xué)特性及耐藥性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,20(9):1035-1041.

[9]XOAO X H,MIAO H M,XU Y G,et al.Analysis of skin and secretions of Dybowski’s frogs (Rana dybowskii) exposed toStaphylococcusaureusorEscherichiacoliidentifies immune response proteins[J].Vet J,2014,200(1):127-132.

[10]LIU C,CHEN Z,TAN C,et al.Immunogenic characterization of outer membrane porins OmpC and OmpF of porcine extraintestinal pathogenicEscherichiacoli[J].FEMS Microbiol Lett,2012,337(2):104-111.

[11]SECUNDINO I,LOPEZ-MACIAS C,CERVANTES-BARRAGAN L,et al.Salmonellaporinsinduce a sustained,lifelong specific bactericidal antibody memory response [J].Immunology,2006,117(1):59-70.

[12]AROCKIASAMY A,MURTHY G S,RUKMINI M R,et al.Conformational epitope mapping of OmpC,a major cell surface antigen fromSalmonellatyphi[J].Structural Biology,2004,148(1):22-33.

[13]DAVIN-REGLI A,BOLLA J M,JAMES C E,et al.Membrane permeability and regulation of drug “influx and efflux” inEnterobacterialpathogens[J].Curr Drug Targets,2008,9:750-759.

[14]于珊,張倩,水小溪,等.致病性雞大腸桿菌pilA基因和外膜蛋白C基因的克隆、表達(dá)及其免疫原性[J].生物工程學(xué)報(bào),2008,24(9):1561-1567.

[15]LI H,YE M Z,PENG B,et al.Immunoproteomic identification of polyvalent vaccine candidates fromVibrioparahaemolyticusouter membrane proteins [J].J Proteome Res,2010,9(5):2573-2583.

[16]LI H,LIN X M,WANG S Y,et al.Identification and antibody-therapeutic targeting of chloramphenicol-resistant outer membrane proteins inEscherichiacoli[J].Journal of Proteome Research, 2007(6),3628-3636.

[17]曹素芳,黃青云,張煜坤,等.禽大腸桿菌外膜蛋白基因C(ompC)的序列分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2004,24(4):332-334.

[18]劉祥.溶藻弧菌附著定植因子ACFA原核載體構(gòu)建、表達(dá)條件優(yōu)化及多克隆抗體制備[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2015,30(1):35-41.

[19]劉祥,李惠.大腸埃希菌主要外膜蛋白OmpA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和誘導(dǎo)條件優(yōu)化[J].生物技術(shù),2013,23(4):32-36.

[20]XU M M,SUN Q,SU R,et al.Microbial transformation of geniposide inGardeniajasminoidesEllis into genipin byPenicilliumnigricans[J].Enzyme and Microbial Technology,2008,42(5):440-444.

[21]劉祥,陳春琳,牟歡,等.重組人骨硬化蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體制備[J].生物技術(shù),2014,24(6):68-72.

[責(zé)任編輯：張存鳳]

Expression,purification and polyclonal antibody

preparation of recombinantE.coliouter membrane protein OmpC

JU Xiong1,CHEN Chun-lin1,LIU Xiang1,WANG Cheng-xiang2,

WANG Ling1,WU San-qiao1,ZHANG Tao1

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology,

Hanzhong 723000, China;

2. Special Education School of Anhui Province Feixi County, Hefei 231200, China)

Abstract:E.coli outer membrane protein (OmpC) could oppose bacterium infection by inducing body immunologic mechanism, and had important perspective in vaccine development. The OmpC protein expression strain was obtained by molecular clone; OmpC was purified by the way of SDS-PAGE gel extraction and urea gradient renaturation, and was used to immunize mice to prepare the polyclonal antibody. The OmpC antibody titer was 1∶6 400 by ELISA, and Western blotting proved that the antiserum had good specificity. OmpC homology analysis by DNAMAN showed that different bacteria had high homology; Phylogenetic analysis of OmpC by MEGA proved the close relationship between intestinal tract pathogenic bacteria. These studies laid the groundwork for the immunological and functional research of OmpC.

Key words:OmpC protein;ELASA;polyclonal antibody;Western blotting