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殘存概率法滅菌程序的設(shè)計與驗證*

徐含青潘建良宋姍姍昝勤楠 / 蘇州市計量測試研究所

摘要對使用殘存概率滅菌法滅菌過程進行程序設(shè)計，并用合適的方法對過程進行驗證。試驗結(jié)果表明，該滅菌程序?qū)崿F(xiàn)了滅菌設(shè)備在受控狀態(tài)下運行，從而達到了需要的滅菌效果。

關(guān)鍵詞滅菌；驗證；殘存概率；F0值

0　引言

隨著人類社會的不斷進步和發(fā)展，微生物的進化和變異對人類的影響日益加劇，從非典爆發(fā)到H7N9禽流感蔓延，無不威脅著人類社會文明的發(fā)展，人們不得不對滅菌質(zhì)量提出更高的要求。WHO（世界衛(wèi)生組織）與世界各國都致力于制定合理的滅菌規(guī)范和標準，用以評價滅菌效果和驗證滅菌工藝。常用的滅菌方法可分為物理滅菌和化學滅菌。物理滅菌又分為干熱滅菌、濕熱滅菌、射線滅菌和濾過滅菌。其中干熱滅菌器包含干熱滅菌柜、隧道式滅菌系統(tǒng)，射線滅菌包含輻射滅菌、紫外滅菌等?；瘜W滅菌包含氣體滅菌和藥液滅菌，其中氣體滅菌主要包括環(huán)氧乙烷滅菌和臭氧滅菌等，藥液滅菌包括甲醛滅菌等。

常規(guī)的濕熱滅菌程序有過度殺滅法以及國際上現(xiàn)今流行的殘存概率法。如何根據(jù)不同的被滅活產(chǎn)品及需要達到無菌保證水平（SAL）進行殘存概率法滅菌程序的設(shè)計與驗證，是本文研究的重點。

1　殘存概率法滅菌的原理與方法設(shè)計

傳統(tǒng)的滅菌方法稱為過度殺滅法。在假設(shè)生物負荷最差情況下，來確定使被滅菌品達到微生物存活概率（SAL）10-6的殺滅時間。該方法針對于被滅活產(chǎn)品耐熱性比較高、不存在長時間高溫產(chǎn)生后續(xù)降解或者影響后續(xù)產(chǎn)品穩(wěn)定性的因素。

1.1幾個重要參數(shù)1.1.1DT值

耐熱參數(shù)：在規(guī)定的滅菌條件下，使所用生物指示劑的數(shù)量下降一個對數(shù)單位，或殺滅90%所需的時間。在濕熱滅菌中，D值需注明參照溫度，即以DT表示。例如，一個D121℃=1.4 min的生物指示劑系統(tǒng)，表示在121 ℃下殺滅90%的芽孢需要1.4 min，其原理如圖1所示。

圖1　耐熱參數(shù)原理圖

1.1.2F值

累計殺滅時間：滅菌效力的度量值。F（T，Z）是在規(guī)定的Z值下，一個滅菌程序賦予一被滅菌物品在參照溫度T ℃下的等效滅菌時間，簡稱T ℃滅菌時間，是滅菌率L對時間的積分值。

1.1.3Z值

降低一個lgD所需要升高的溫度：即滅菌時間降低到原來的1/10所需要升高的溫度或在相同滅菌時間內(nèi)，殺滅99%的微生物所需要提高的溫度。其實驗值一般為：濕熱滅菌Z=10、干熱滅菌Z=20、干熱滅菌除熱源Z=54。

1.1.4L值

滅菌率：用式（1）計算

式中，參照溫度121.1 ℃在數(shù)學上近似250°F，實際工作中為簡化計算，一般采用121 ℃。

1.1.5F0值

標準滅菌時間：是指Z取10 ℃時，一個濕熱滅菌程序賦予被滅菌品121.1 ℃下滅菌的等效滅菌時間。例如，當生物指示劑的Z取10 ℃，F(xiàn)（T = 121.1 ℃，Z=10 ℃）賦予被滅菌品8 min的程序，或F0為8，與一個116 ℃滅菌25.9 min方形滅菌波是等效的（F0均為8），使用式（2）計算：

1.2殘存概率法滅菌原理

殘存概率法對產(chǎn)品的后續(xù)降解可產(chǎn)生最小的影響水平，有利于被滅活產(chǎn)品的穩(wěn)定性。正是由于這個原因，該方法更適合于耐熱性較差的滅菌物品，也是當前濕熱滅菌的主要工藝。殘存概率法的滅菌原理基于微生物的死亡符合一級動力學規(guī)則，殺滅率是耐熱性的函數(shù)，與微生物的數(shù)量無關(guān)。殘存概率曲線可用如下函數(shù)與圖2表示：

式中：NF— 滅菌F 分鐘后微生物存活的數(shù)量；

N0— 初始微生物的數(shù)量；

F（T，Z） — 滅菌程序在確定的溫度系數(shù)Z下的T ℃等效滅菌時間；

DT— 微生物以分鐘為單位的T ℃耐熱參數(shù)，該特定溫度必須與F值計算中所采用的溫度相一致

圖2　“殘存概率法”滅菌原理

1.3殘存概率法滅菌方法設(shè)計

根據(jù)以上參數(shù)與原理，即可設(shè)計出一定無菌保證水平（SAL）的滅菌程序。自然界中很少能夠檢到D121℃> 0.5 min的微生物，為設(shè)計過程降低風險，取DT值為2.5 min，為風險點的5倍，初始微生物數(shù)量一般制藥企業(yè)可達萬級水平，為降低設(shè)計過程風險，放大取初始微生物數(shù)量100倍，假定為106。

如果滅菌設(shè)計時間為30 min，經(jīng)計算即可得到NF為10-6，也就是說，滅菌30 min，無菌保證水平（SAL）為一百萬分之一。設(shè)計過程如下，該過程也就是常用的過度殺滅過程：

lgNF=-F0/2.5+lg106

lgNF=-30/2.5+lg106

lgNF=-12+6

lgNF=-6

NF=10-6

而常規(guī)的設(shè)計程序需要驗證其F0值，也就是根據(jù)設(shè)計程序來計算出等效的標準滅菌時間。將公式重新排列，設(shè)計過程如下，取DT值為2.5 min，為風險點的5倍，目標無菌保證水平為2 000，設(shè)計過程如下：

F0=（lgN0-lgNF）DT

F0=（lg106-lg2×103）×2.5

F0=（6-3.3）×2.5

F0=6.75 min

根據(jù)以上設(shè)計過程，即可根據(jù)實際情況進行風險評估，假設(shè)初始的微生物數(shù)量，適量放大DT值的取值倍數(shù)來任意設(shè)計滅菌程序，以達到一定的無菌保證水平（SAL）目標。

2　殘存概率法滅菌過程的實驗驗證

由于我國《藥品生產(chǎn)驗證指南》（2003版）、《消毒技術(shù)規(guī)范》《藥典》均沒有對物理參數(shù)進行驗證的實際操作規(guī)范可以參考，現(xiàn)依據(jù)歐盟標準EN554《Validation and routine control of sterilization by moist heat-English version of DIN EN554》和英國標準HTM2010《Health Technical Memorandum 2010》進行物理參數(shù)驗證，并根據(jù)上述標準的技術(shù)指標，對檢測結(jié)果進行分析。

2.1選用的測試設(shè)備

如表1所示。

表1　測試設(shè)備技術(shù)指標

2.2測試對象

如表2所示。

2.3布點情況

分布方式為12個溫度點，1個壓力測試點，測量時傳感器測量探頭不能接觸料架表面，根據(jù)HTM2010的建議，排水口處分布1個溫度點，其他溫度點均勻分布，如圖3所示。

表2　測試對象技術(shù)指標

2.4滅菌目的

負載SAL≤10-6。

2.5驗證部分

由于數(shù)據(jù)量極大，截取部分數(shù)據(jù)如表3所示。

2.6計算F0值

計算部分由于數(shù)據(jù)量極大，截取部分數(shù)據(jù)如表4所示。

圖3　傳感器布放位置實物圖

表3　驗證實際數(shù)據(jù)

表4　F0值實際計算過程數(shù)據(jù)

3　結(jié)語

通過以上一系列原理與驗證實驗過程的敘述，深入分析了殘存概率法滅菌程序在生物制藥企業(yè)無菌保證工藝過程中的應(yīng)用，在實踐過程中，需要依

據(jù)以上原理來驗證各個設(shè)計出來的滅菌過程的質(zhì)量，綜合考慮空載、滿載、半載等各種裝載的影響，以及蒸汽質(zhì)量對熱穿透效果的影響。國內(nèi)由于GMP實施的時間較晚，技術(shù)能力還比較薄弱，很多先進的理念還沒有及時采用，導致很多風險點的產(chǎn)生，因此必須不斷學習總結(jié)，在采用國際先進標準的同時，善于分析，從而解決應(yīng)用過程中的實際問題，為進一步提高積累經(jīng)驗。

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validation and verification [M] . NHS Estates, An Executive Agency of the British Department of Health，1998.

Design and verification of the sterilization program according to bioburden based process

Xu Hanqing, Pan Jianliang, Song Shanshan,

Zan Qingnan

（Suzhou Institute of Measurement and Testing Technology）

Abstract:According to bioburden based process, a sterilization program has been designed, and verificated by appropriate means. The testing results showed that sterilizing equitments operated in a controlled state, and the desired effect of sterilization has been achieved.

Key words:sterilization; verification; bioburden based process; F0value

*基金項目：蘇州市科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計劃資助項目（ZXJ2013002）