石玉也+鹿愛娟+黃小燕+陳傳品+劉文芳

摘要：表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）作為一種新興的藥物分析手段，具有樣本處理簡(jiǎn)單、非侵入性檢測(cè)、靈敏度高、提供豐富指紋圖譜信息等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)現(xiàn)高靈敏度無損檢測(cè)的同時(shí)可獲得目標(biāo)檢測(cè)物的分子結(jié)構(gòu)信息。本文綜合論述了體內(nèi)藥物分析的常用方法以及SERS在該方面的發(fā)展現(xiàn)狀，并詳細(xì)介紹了SERS基底的分類和制備方法以及SERS在藥物分析尤其是體內(nèi)藥物分析方面的應(yīng)用。針對(duì)體內(nèi)藥物分析，主要介紹不分離樣本情況下，SERS用于唾液、尿液、血液等生物樣本中目標(biāo)檢測(cè)物的直接分析技術(shù)。

關(guān)鍵詞：體內(nèi)藥物分析；生物樣本；表面增強(qiáng)拉曼光譜

中圖分類號(hào)：G642 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2015）15-0053-03

一、前言

表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）是一種利用表面電磁場(chǎng)增強(qiáng)提高拉曼信號(hào)的分析技術(shù)。與紅外（IR），紫外（UV），核磁共振（NMR），熒光，X-衍射等光學(xué)分析手段相比，具有很多突出優(yōu)勢(shì)。表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)限非常低，可用于痕量分析，甚至可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)檢測(cè)物的單分子檢測(cè)；分析過程只需要數(shù)毫秒到數(shù)十秒不等，可實(shí)現(xiàn)對(duì)被分析物快速檢測(cè)和實(shí)時(shí)信息反饋；能夠提供豐富的指紋圖譜信息而具有較高的分析準(zhǔn)確性；水分子的拉曼響應(yīng)較弱，因此適用于含水樣本的分析，尤其是生物樣本，無需復(fù)雜的前處理即可檢測(cè)；與其他分析方法如IR，核磁共振等相比，對(duì)樣本純度要求低，可大大減少樣本前處理工作并節(jié)約分析成本；拉曼檢測(cè)所需樣本量極少，且為非入侵破壞性檢測(cè)，可為目標(biāo)檢測(cè)物的后續(xù)分析提供方便。因其可以從復(fù)雜基質(zhì)中提取目標(biāo)分子結(jié)構(gòu)信息，故表面增強(qiáng)拉曼光譜尤其適用于生命科學(xué)方面的分析應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析是指利用儀器對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)的血液、尿液、體液、排泄物、組織、器官等樣本中藥物及其代謝物的分布進(jìn)行分析，了解藥物進(jìn)入體內(nèi)后代謝的途徑以及代謝方式等信息，從而指導(dǎo)藥品的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用。體內(nèi)藥物分析最大的挑戰(zhàn)是生物樣品成分復(fù)雜、藥物及其代謝物濃度低。一般而言，樣本中除了目標(biāo)檢測(cè)物外，還含有大量的蛋白質(zhì)、多種內(nèi)源性物質(zhì)等，而藥物本身的代謝產(chǎn)物、其他共存的藥物等也會(huì)對(duì)檢測(cè)形成一定的影響。因此其對(duì)分析儀器的分離效率和檢測(cè)限有較高要求。表面增強(qiáng)拉曼光譜由于其超高的靈敏度和指紋圖譜分析等優(yōu)勢(shì)，在體內(nèi)藥物分析方面展現(xiàn)了良好的前景。

二、體內(nèi)藥物分析常用方法

目前常用的幾類生物樣品分析方法有：①色譜法，可用于大多數(shù)藥物的檢測(cè)。②免疫學(xué)方法，多用于蛋白質(zhì)多肽類物質(zhì)檢測(cè)。③微生物學(xué)方法，主要用于抗菌藥物的測(cè)定。

三、表面增強(qiáng)拉曼散射簡(jiǎn)介

與紅外光譜相似，拉曼光譜是一種分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)光譜。但前者是通過檢測(cè)分子偶極矩的變化，而后者則通過分子極化率的改變獲得相關(guān)信息。普通拉曼光譜的信號(hào)響應(yīng)非常弱，其強(qiáng)度大約只有激發(fā)光的10-10倍。同時(shí)，普通拉曼光譜的熒光干擾非常強(qiáng)，即便是目標(biāo)物或者基質(zhì)中極弱的熒光響應(yīng)，也能覆蓋拉曼散射。20世紀(jì)70年代，F(xiàn)leischmann等首次報(bào)道了在粗糙的銀電極表面吸附的單層吡啶的高質(zhì)量拉曼光譜。三年后，Van Duyne等證明吸附在粗糙銀表面的每個(gè)吡啶分子的拉曼信號(hào)強(qiáng)度在比其在溶液中增強(qiáng)了106倍。該現(xiàn)象被定義為表面增強(qiáng)效應(yīng)。SERS是指當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)分子被吸附到某些粗糙的金屬表面（如金、銀、銅等）上時(shí)，它們的拉曼散射強(qiáng)度會(huì)增加104～106倍；諧振時(shí)，可以高達(dá)1014～1015倍，其中又以銀的增強(qiáng)效果最佳。目前認(rèn)為SERS增強(qiáng)主要基于電磁場(chǎng)增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)兩種機(jī)制，納米粒子的形貌尺寸以及與相鄰納米粒的距離均會(huì)影響粒子周圍的電磁場(chǎng)，進(jìn)而影響增強(qiáng)效果，并且被測(cè)分子只有位于金屬納米粒產(chǎn)生的電磁場(chǎng)中時(shí)才會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的效果，電磁場(chǎng)越強(qiáng)，增強(qiáng)效果越好。目前SERS技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、材料學(xué)、電化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)等各個(gè)方面。

四、表面增強(qiáng)拉曼散射用于藥物分析

SERS應(yīng)用于藥物分析是近幾年才發(fā)展起來的。拉曼光譜可以從以下幾個(gè)方面應(yīng)用于藥物分析：①藥物的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)鑒定：拉曼光譜已經(jīng)被用于多種藥物的結(jié)構(gòu)分析，包括苯乙胺類鎮(zhèn)靜催眠藥、手性的β受體阻斷劑，鎮(zhèn)靜催眠藥等。②對(duì)活性成分的定量分析：目前已有通過偏最小二乘法和線性回歸分析阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚的拉曼數(shù)據(jù)，進(jìn)行定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。在選定的拉曼光譜頻率區(qū)間內(nèi)，通過改變參數(shù)可以對(duì)藥物中的活性成分進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。通過對(duì)拉曼光譜的分析，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了抗生素中含有的對(duì)乙酰氨基酚單斜和正交晶系含量的準(zhǔn)確檢測(cè)。③藥物的晶型的分析：拉曼光譜也可以用于藥物的多晶型分析。鹽酸雷尼替丁片中包含有兩種晶型的藥物——Ⅰ型和Ⅱ型，這兩種晶型可以采用拉曼光譜進(jìn)行區(qū)別并確定含量。該研究認(rèn)為，拉曼光譜是一種可以用于定量分析晶型含量的有效方法，商業(yè)藥品中的多晶型雜質(zhì)應(yīng)低于2%。目前，SERS用于藥物分析的相關(guān)研究主要集中在藥物標(biāo)準(zhǔn)品等純度較高體系的分析。已有相關(guān)研究包括檢測(cè)苯丙胺、地西泮等精神類藥物，嗎啡、可待因等麻醉藥物，地蟲硫磷等農(nóng)藥，另外還有5-氟尿嘧啶，利福霉素，阿司匹林等。這些研究多以銀納米溶膠為增強(qiáng)基質(zhì)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣本中的藥物，其最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到10-6 mol/L。采用SERS分析生物的樣本中的目標(biāo)檢測(cè)物也有一定測(cè)嘗試。

五、表面增強(qiáng)拉曼散射用于體內(nèi)藥物分析

直接檢測(cè)是表面增強(qiáng)拉曼散射最普遍的檢測(cè)方式，目標(biāo)分子吸附在金屬納米粒上，即可得到目標(biāo)分子的指紋圖譜。大分子和小分子物質(zhì)的痕量檢測(cè)都有大量的文獻(xiàn)報(bào)道。用于生物樣本中的直接檢驗(yàn)主要針對(duì)于單一目標(biāo)檢測(cè)，根據(jù)生物樣本的種類，可分為唾液樣本分析，尿液樣本分析和血液樣本分析。唾液分析相對(duì)血漿等常用生物樣本有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。首先，樣本的獲得不會(huì)對(duì)受試者產(chǎn)生創(chuàng)傷，減少了試驗(yàn)的危險(xiǎn)性和不良事件的產(chǎn)生。其次唾液成分簡(jiǎn)單，99.5%以上的成分都是水，因此對(duì)樣本的處理要求也相對(duì)簡(jiǎn)單而可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。第三，在微克級(jí)別時(shí)，唾液中的藥物含量與血液中的濃度幾乎是一致的。采用硅醇還原銀或金離子獲得SERS活性的毛細(xì)管，唾液中5-氟尿嘧啶，毒品（苯丙胺、地西泮、美沙酮、可卡因）等的檢測(cè)均已實(shí)現(xiàn)，但技術(shù)尚不成熟，檢測(cè)限也較高。前者先加水對(duì)唾液進(jìn)行稀釋，在去除硫氰酸根離子等的干擾后，其5-氟尿嘧啶的檢測(cè)限可以達(dá)到50μg/mL。Frank Inscore等對(duì)唾液樣本進(jìn)行固相萃取后，將其注入含金或銀溶膠的毛細(xì)管，并采用便攜式拉曼光譜儀檢測(cè)，分別檢測(cè)出了樣本中含有的可卡因、苯丙胺、海洛因等藥物。其檢測(cè)限雖只有0.5μg/mL，但采用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，為樣本的現(xiàn)場(chǎng)鑒定和實(shí)時(shí)檢測(cè)提供了可能。endprint

尿液是一種常見的樣本，在美國，每年大約有3億的尿液相關(guān)分析。Charles J. Choi在常用的IV或尿液收集軟管中嵌入了緊密排列的納米汞和SERS傳感器，實(shí)現(xiàn)了人工尿液中異丙嗪和尿素的在線定量監(jiān)測(cè)。其濃度—信號(hào)強(qiáng)度曲線的相關(guān)系數(shù)為0.999，其檢測(cè)限大約為3mg/mL。Gerd Trachta等采用HPLC-SERS聯(lián)用的方法檢測(cè)了尿液和血液中的雙氫可待因、多賽平、西酞普蘭，曲米帕明，卡馬西平，美沙酮等藥物含量。該方法用乙酸乙酯對(duì)樣本進(jìn)行萃取富集后，再采用HPLC進(jìn)行分離，根據(jù)保留時(shí)間取分離后的樣本至SERS增強(qiáng)基底上，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)SERS分析。采用該方法，他們檢測(cè)了兩個(gè)過量使用精神藥物而致死患者的尿液和血液，獲得了相關(guān)藥物的SERS圖譜。血液是人體組織的重要組成部分，當(dāng)人體組織處于不同狀態(tài)或人生理狀況發(fā)生變化時(shí)，體內(nèi)代謝物質(zhì)在血液中將有所反映，通過分析人血液的拉曼光譜以實(shí)現(xiàn)人體疾病的檢測(cè)是國內(nèi)外學(xué)術(shù)界關(guān)注的研究課題，按照全血取樣后的處理方法，又包括血漿和血清兩種。表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）技術(shù)具有高檢測(cè)靈敏度、可提供指紋圖譜、樣品前處理簡(jiǎn)便，同時(shí)血液中富含的各種生化物質(zhì)容易與金屬納米粒子相結(jié)合，因此，將SERS技術(shù)應(yīng)用于人體血液檢測(cè)具有特別的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)血液樣本具有易于獲得，容量較大，相關(guān)報(bào)道較多而易于對(duì)比借鑒等優(yōu)點(diǎn)。其中，血液中抗癌藥物的SERS檢測(cè)具有重大意義?？拱┧幬锔弊饔门c用藥劑量有顯著關(guān)系，故通過個(gè)體化監(jiān)測(cè)血藥濃度來調(diào)整給藥劑量可顯著降低抗癌藥物的副作用，提高病人對(duì)藥物的耐受性。Yuen C等用SERS檢測(cè)血漿樣本中的紫杉醇。其以微波處理金薄膜-聚乙烯顆粒，獲得重現(xiàn)性較高，增強(qiáng)效果非常好的增強(qiáng)基底。其標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本基本不需要進(jìn)一步處理即可進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)限可以達(dá)到10-8mol/L。

六、總結(jié)

SERS由于其超高的靈敏度，在體內(nèi)藥物分析中的發(fā)展不容小覷，雖然目前技術(shù)尚不成熟，但其基礎(chǔ)研究與應(yīng)用越來越受到大家的重視。目前，SERS應(yīng)用于體內(nèi)藥物分析面臨的主要問題是：生物樣本的背景干擾太強(qiáng)，影響檢測(cè)；檢測(cè)限太高，難以達(dá)到體內(nèi)藥物分析的要求；常規(guī)方法所得基質(zhì)重現(xiàn)性較差，難以應(yīng)用過于體內(nèi)藥物分析。這些問題都需要通過改進(jìn)增強(qiáng)基底加以改進(jìn)，尤其是好的增強(qiáng)基底不僅需要有足夠的增強(qiáng)效果，更需要能滿足體內(nèi)藥物分析的重現(xiàn)性。目前已經(jīng)有針尖增強(qiáng)拉曼光譜、各種有序的納米粒陣列、甚至復(fù)合增強(qiáng)基底，可以實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)且能保證一定的重現(xiàn)性。同時(shí)編碼納米粒以其能植入芯片、活細(xì)胞、組織和一些列微小器官進(jìn)行間接檢測(cè)，展現(xiàn)出廣大的應(yīng)用前景。但其應(yīng)用均停留在實(shí)驗(yàn)室制備階段，距離推廣使用還有一定的距離。而將SERS分析發(fā)展成為一種標(biāo)準(zhǔn)的體內(nèi)藥物分析手段則還需要更多的深入研究。

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