周 紅(綜述)，張 波(審校)

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院廣西婦產(chǎn)醫(yī)院廣西兒童醫(yī)院生殖中心，南寧530003)

人類輔助生殖技術(shù)的理想結(jié)局是生育一個(gè)健康胎兒，關(guān)注點(diǎn)不僅是臨床妊娠率，更在于單胎活產(chǎn)率。體外受精(in vitro fertilization，IVF)及其衍生技術(shù)發(fā)展已三十余年，胚胎成功植入與功能正常的囊胚、良好子宮容受性及其相互作用有關(guān)，因此對(duì)胚胎體外培養(yǎng)的研究逐漸細(xì)化而深入。研究顯示，與卵裂期胚胎移植相比，移植囊胚期胚胎臨床種植率較高，囊胚培養(yǎng)技術(shù)日益成熟，使移植胚胎策略逐漸向單囊胚移植傾斜，從而提高活產(chǎn)率、降低多胎率［1-2］。但受體外培養(yǎng)環(huán)境所限，并非所有高評(píng)分的卵裂期胚胎都能體外發(fā)育至囊胚期。在現(xiàn)階段，充分認(rèn)識(shí)囊胚培養(yǎng)的利與弊，有利于獲得更好的助孕結(jié)局。現(xiàn)就囊胚培養(yǎng)的利與弊予以綜述。

1 囊胚培養(yǎng)的益處

1.1 胚胎的進(jìn)一步篩選和修復(fù)人類胚胎培養(yǎng)發(fā)育首先是卵裂期胚胎，再到種植前囊胚期胚胎。其代謝有兩個(gè)不同階段，一是從受精到胚胎基因組的激活，二是從基因組激活到種植。通過動(dòng)物及人胚胎的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，早卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)上的特點(diǎn)不能真正揭示胚胎本身的發(fā)育潛能和信息，體外繼續(xù)培養(yǎng)的過程中，沒有發(fā)育潛能的胚胎或攜帶有異常染色體和基因的胚胎常被自然篩選掉，只有質(zhì)量好的胚胎才能發(fā)育至囊胚期［3-4］。Staessen等［5］研究提示，經(jīng)過熒光原位雜交技術(shù)對(duì)不同階段胚胎非整倍體篩查的結(jié)果顯示，8細(xì)胞卵裂期胚胎染色體正常率為41.3%，而繼續(xù)培養(yǎng)至第5日囊胚期染色體正常率為65%，其種植機(jī)會(huì)增加，妊娠率高于卵裂期胚胎;部分染色體異常且質(zhì)量差的胚胎在體外繼續(xù)培養(yǎng)，無法進(jìn)一步發(fā)育。人類胚胎自然流產(chǎn)的首要原因與胚胎染色體的數(shù)目發(fā)生異常即非整倍體的產(chǎn)生有關(guān)。一項(xiàng)前瞻性研究對(duì)第3日診斷為非整倍體狀態(tài)的83個(gè)卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至第5日再做活檢，發(fā)現(xiàn)能發(fā)育至囊胚期的胚胎與發(fā)育至致密桑葚胚階段的胚胎相比有較高的自我糾正率(38.1%比24.2%)，說明隨著胚胎體外培養(yǎng)至囊胚期，其染色體異常(非整倍體和嵌合型胚胎)有可能獲得改善及修復(fù)，更佳地評(píng)估胚胎后基因組激活［6］。一項(xiàng)回顧性薈萃分析結(jié)果顯示，在IVF/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)中，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植明顯增加活產(chǎn)率［7］。

1.2 子宮環(huán)境更適于胚胎種植 胚胎的成功植入需要功能正常的囊胚和良好的子宮內(nèi)膜容受性，并且需兩者相互作用及多系統(tǒng)旁分泌的調(diào)控。人類子宮與輸卵管的環(huán)境分別適合不同類型胚胎發(fā)育，在自然妊娠中卵裂期胚胎在輸卵管發(fā)育，子宮種植最佳時(shí)期是囊胚期。在對(duì)胚胎干細(xì)胞的相關(guān)研究中提示，囊胚的形成從細(xì)胞融合到囊胚腔出現(xiàn)、擴(kuò)張，經(jīng)歷了從母體調(diào)節(jié)向胚胎調(diào)節(jié)的基因調(diào)控轉(zhuǎn)換［8］。自然妊娠中，胚胎種植于子宮的階段就是囊胚期，因此，囊胚期移植胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更佳。Fanchin等［9］的研究表明，囊胚移植階段子宮收縮頻率明顯低于卵裂期胚胎移植階段［(1.5±0.2)次/min比(4.4±0.2)次/min］，該階段子宮收縮明顯減少，有利于避免胚胎被宮縮排出，更有利于胚胎種植。同時(shí)，囊胚期胚胎體積較大，子宮收縮較小，相關(guān)研究提示囊胚移植患者異位妊娠的發(fā)生率較低［10］。

1.3 單囊胚移植是可接受的移植策略 在IVF-胚胎移植中，由于無法真正預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能，為了保證一定的臨床妊娠率，往往移植2～3枚卵裂期胚胎，通過增加移植胚胎數(shù)期望能增加妊娠率，因此，多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，多胎妊娠率可高達(dá)25%～50%，甚至出現(xiàn)較多的高序多胎妊娠［11］。一些隨訪資料提示，由于移植胚胎數(shù)目2～3個(gè)，致雙胎妊娠發(fā)生率增加了70%，三胎妊娠發(fā)生率增加了400%［12］。當(dāng)胚胎培養(yǎng)到囊胚期，通過評(píng)估已分化的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)外胚層，使選擇單個(gè)發(fā)育潛能高、較高種植率的囊胚進(jìn)行移植成為可能，既可以得到較高的妊娠率，又能有效降低多胎妊娠率［13］。研究顯示，采取選擇性單囊胚移植策略干預(yù)后，移植胚胎數(shù)目明顯降低(由2.12枚減為1.60枚)，胚胎種植率及臨床妊娠率明顯提高，多胎妊娠率明顯降低(由29.37%降為15.38%)［14］。

1.4 體外延長(zhǎng)培養(yǎng)提高胚胎利用率 按照現(xiàn)有的卵裂期胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分體系，取卵后第3日，對(duì)低評(píng)分的胚胎冷凍保存的意義不大，但對(duì)307枚低評(píng)分胚胎體外延長(zhǎng)培養(yǎng)的研究提示，低評(píng)分胚胎體外延長(zhǎng)培養(yǎng)后囊胚形成率為17.26%［15］。甄璟然等［16］的研究也認(rèn)為，取卵后體外培養(yǎng)第3日形態(tài)學(xué)較低質(zhì)量的胚胎仍有部分具有發(fā)育至囊胚的潛能(低質(zhì)量胚胎總的囊胚形成率27.56%)，在第3日時(shí)對(duì)這些胚胎繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)至第6日，可能減少胚胎的浪費(fèi)并得到更好臨床結(jié)局。另有學(xué)者研究提出，現(xiàn)有的胚胎評(píng)分方法在第3日認(rèn)為無冷凍價(jià)值的非優(yōu)質(zhì)胚胎，仍具有不同程度的發(fā)育潛能，通過繼續(xù)體外培養(yǎng)，進(jìn)一步篩選出具有發(fā)育潛能的胚胎，繼而冷凍保存囊胚，可提高患者的累積妊娠率，從而可以最大限度地利用胚胎，減少患者的損失［10，17］。

1.5 有利于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的開展 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷是輔助生殖技術(shù)與遺傳學(xué)診斷技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，該技術(shù)的重要環(huán)節(jié)之一在于囊胚培養(yǎng)技術(shù)。胚胎活檢一般在胚胎發(fā)育的兩個(gè)時(shí)間段進(jìn)行，一是在受精后第3日發(fā)育至6～8個(gè)細(xì)胞階段的卵裂期胚胎，取全能性的卵裂球1～2個(gè)細(xì)胞活檢，胚胎繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育形成囊胚，再根據(jù)活檢結(jié)果，選擇囊胚期胚胎進(jìn)行移植;另一方面是胚胎培養(yǎng)至囊胚期，取胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞10個(gè)以上細(xì)胞進(jìn)行活檢，不僅可增加可供診斷的細(xì)胞數(shù)，提高準(zhǔn)確率，同時(shí)，取滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢對(duì)胎兒發(fā)育的影響較小;但由于囊胚期活檢檢測(cè)結(jié)果后至，需要期待凍融周期移植［18］。

1.6 凍融囊胚復(fù)蘇率及著床率較高 胚胎冷凍保存是人類輔助生殖技術(shù)中不可缺少的一部分，在提高累積妊娠率、增加移植機(jī)會(huì)等方面起重要作用。在玻璃化冷凍保存胚胎體系不斷完善后，凍融囊胚的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在:①囊胚細(xì)胞數(shù)目多;②滋養(yǎng)層細(xì)胞損傷后修復(fù)能力強(qiáng);③囊胚細(xì)胞小且表面積/體積比大，對(duì)脫水、復(fù)水造成的體積變化耐受性更佳;④囊胚復(fù)蘇后很快能判斷是否存活等［19］。研究表明，囊胚冷凍保存較卵裂期胚胎的復(fù)蘇率高、臨床種植率高［20］。因此，在囊胚移植數(shù)目減少的情況下，凍融囊胚復(fù)蘇可有效提高IVF技術(shù)的累積妊娠率及活產(chǎn)率。

2 囊胚培養(yǎng)面臨的問題

2.1 繼續(xù)培養(yǎng)需要更高標(biāo)準(zhǔn)的胚胎實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境 胚胎體外培養(yǎng)，在不同時(shí)期對(duì)胚胎培養(yǎng)液成分的要求是不同的。卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，形成囊胚的影響因素很多，尤其對(duì)實(shí)驗(yàn)室的體外培養(yǎng)體系有更高要求。胚胎在發(fā)育至8細(xì)胞水平晚期將發(fā)生致密化，為胚胎進(jìn)一步細(xì)胞分化成滋養(yǎng)細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)奠定結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。胚胎致密化后糖酵解成為重要的能量產(chǎn)生通路，胚胎此時(shí)對(duì)葡萄糖的利用度增加，有高度依賴性。從卵裂期胚胎到囊胚期胚胎還需要(如蛋白、氨基酸等)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均衡，培養(yǎng)液的滲透壓、溫度、酸堿度等的調(diào)節(jié)及胚胎實(shí)驗(yàn)室優(yōu)良的培養(yǎng)環(huán)境、無菌條件、人員操作、質(zhì)控等，使實(shí)驗(yàn)室工作量也因此增加［19，21］，同時(shí)繼續(xù)培養(yǎng)還應(yīng)該盡量縮短胚胎在培養(yǎng)箱外暴露的時(shí)間，才能降低外界環(huán)境對(duì)胚胎的損傷。體外培養(yǎng)條件不良最終影響囊胚形成率及種植率、活產(chǎn)率。

2.2 體外延長(zhǎng)培養(yǎng)有無囊胚形成而取消周期的風(fēng)險(xiǎn) 對(duì)高齡不孕婦女而言，獲卵數(shù)較少、形成胚胎較少，繼續(xù)培養(yǎng)最終無胚胎移植的周期取消率會(huì)明顯增高。Glujovsky等［22］分析顯示，囊胚移植在活產(chǎn)率方面優(yōu)于卵裂期胚胎移植(32%比42%)，但囊胚移植組延長(zhǎng)的培養(yǎng)可能無囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累計(jì)妊娠率優(yōu)于囊胚移植(56.8%比46.3%)，囊胚移植未顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。顧亦凡等［23］的研究顯示，人類發(fā)育欠佳胚胎僅有20.9%能培養(yǎng)到囊胚階段，有53.8%的患者由于繼續(xù)培養(yǎng)無囊胚形成而取消周期，因此，對(duì)于人類發(fā)育遲緩或形態(tài)不佳的胚胎，不建議繼續(xù)進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，盡量在第3日進(jìn)行胚胎移植。

2.3 雙囊胚移植將產(chǎn)生更高的多胎妊娠率 囊胚的臨床種植率在40%～50%［18，24］，在我國(guó)，目前移植胚胎策略未針對(duì)移植囊胚的數(shù)目作出界定，雙囊胚移植在獲得可能高的臨床妊娠率的同時(shí)，必然導(dǎo)致醫(yī)源性的多胎妊娠率進(jìn)一步增加，相應(yīng)的臨床助孕的并發(fā)癥及產(chǎn)科風(fēng)險(xiǎn)增加。不孕夫婦受國(guó)家計(jì)劃生育相關(guān)政策限制只生一胎，患者不僅希望妊娠，也追求雙胎妊娠，往往難以接受單囊胚移植;當(dāng)然，隨著單獨(dú)二胎政策的實(shí)施，這類情況可能會(huì)有所改善。Nyboe Andersen等［25］的研究指出，選擇性單胚胎移植與雙胚胎移植的累積活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但關(guān)鍵在于累積治療的周期數(shù)。

2.4 可能增加出生嬰兒性別偏倚及單卵雙胎的風(fēng)險(xiǎn) 囊胚培養(yǎng)、移植在很大程度上均是采用最優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，相對(duì)男性胚胎的發(fā)育速度顯著快于女性胎兒，是否因此導(dǎo)致男胎出生比率高，尚有爭(zhēng)議。Chang等［26］報(bào)道，囊胚移植導(dǎo)致男性嬰兒出生比例升高，且單卵雙胎發(fā)生率增加。但一些研究顯示，胚胎性別與胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)級(jí)有關(guān)，與是否采取囊胚移植無關(guān);延長(zhǎng)胚胎體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，男性胚胎發(fā)育速度顯著快于女性胚胎，在5AA/6AA的囊胚中有72%為男性胚胎，三級(jí)胚胎中僅有40%為男性胚胎［27］。另外，造成單卵雙胎的具體原因仍不清楚，可能與婦女的年齡、卵巢刺激、體外延長(zhǎng)培養(yǎng)、體外培養(yǎng)條件的改變以及透明帶的損傷等有關(guān)。一項(xiàng)對(duì)9篇文獻(xiàn)超過40 000個(gè)周期的薈萃分析表明，囊胚培養(yǎng)似乎是導(dǎo)致單卵雙胎的一個(gè)重要因素［24］。對(duì)ICSI的研究提示，囊胚期胚胎移植單卵雙胎發(fā)生率明顯高于卵裂期胚胎(3.9%比0.7%)［28］，推測(cè)對(duì)透明帶的操作及輔助孵化處理可能是囊胚移植單卵雙胎發(fā)生率增加的原因。而Papanikolaou等［29］對(duì)1951例新鮮IVF/ICSI周期的回顧性研究表明，與卵裂期單胚胎移植相比，單囊胚移植并不增加單卵雙胎的風(fēng)險(xiǎn)(2.6%比1.8%)。另有研究顯示，移植囊胚與卵裂期胚胎單卵雙胎率無差異，囊胚培養(yǎng)并未增加單卵雙胎的發(fā)生率［14］。單卵雙胎的發(fā)生可能與輔助生殖技術(shù)中的一些操作(如輔助孵化、ICSI、胚胎活檢等)相關(guān)，但與囊胚培養(yǎng)的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

2.5 基因印記異常風(fēng)險(xiǎn)可能隨體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加在輔助生殖技術(shù)中，IVF、胚胎體外培養(yǎng)的過程是基因印跡擦除、建立和維持的關(guān)鍵窗口期，體外環(huán)境可能干擾胚胎基因印記，導(dǎo)致相關(guān)遺傳性疾病的發(fā)生率上升。一些研究發(fā)現(xiàn)，基因印記缺陷可能與母系位點(diǎn)低甲基化、超排卵和胚胎體外培養(yǎng)有關(guān)［30］。在許多動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)胚胎的延長(zhǎng)培養(yǎng)、培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)液成分等的變化，可能導(dǎo)致印跡基因的改變［31］。一項(xiàng)對(duì)小鼠單個(gè)囊胚DNA甲基化的微陣列分析結(jié)果表明，體外培養(yǎng)過程、囊胚冷凍的人工皺縮技術(shù)、冷凍保存等可能產(chǎn)生廣泛的基因效應(yīng)［32］。囊胚培養(yǎng)增加了胚胎體外操作及培養(yǎng)的時(shí)間，囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對(duì)培養(yǎng)液中的成分變化更敏感，對(duì)培養(yǎng)基耐受性較差，可能潛在損傷更多。

3 選擇性囊胚培養(yǎng)與單囊胚移植使其優(yōu)勢(shì)最大化

人類輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，終極目標(biāo)是輔助生殖回歸自然。囊胚培養(yǎng)、移植的主要優(yōu)勢(shì)在于其是有效、易行的胚胎選擇方法，并有較高的種植率，使單胚胎移植效率提高，并提高累積妊娠率及活產(chǎn)率。因此，胚胎實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境在滿足囊胚培養(yǎng)的更高要求后，對(duì)于年輕、卵巢反應(yīng)好的患者，選擇性單囊胚移植應(yīng)該是較有效率的助孕策略。另一方面，對(duì)于卵巢反應(yīng)差、胚胎數(shù)量少的患者，考慮到繼續(xù)培養(yǎng)的風(fēng)險(xiǎn)，可能依然是采用卵裂期胚胎移植更為合適。

4 小結(jié)

正確看待囊胚培養(yǎng)的利弊，利用有效胚胎體外培養(yǎng)體系進(jìn)一步篩選胚胎，充分發(fā)揮IVF技術(shù)優(yōu)勢(shì)，結(jié)合臨床促排卵與子宮內(nèi)膜等方案選擇的探索，選擇性地將具有高發(fā)育潛能的單個(gè)囊胚移植到適宜種植的子宮內(nèi)，既維持可接受的臨床妊娠率，又有效控制了多胎妊娠率，最終實(shí)現(xiàn)單胎活產(chǎn)，達(dá)到輔助生殖技術(shù)的理想目標(biāo)。

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