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微RNA的特征概述及其研究進(jìn)展

2015-12-09 16:35鐘阿紅張振宇綜述余進(jìn)進(jìn)吳亦波審校
醫(yī)學(xué)綜述 2015年19期
關(guān)鍵詞:生物體前體信息學(xué)

鐘阿紅,張振宇(綜述),余進(jìn)進(jìn),吳亦波(審校)

(1.蘇州大學(xué)附屬第四醫(yī)院婦產(chǎn)科,江蘇無錫214062;2.江南大學(xué)附屬醫(yī)院無錫市第四人民醫(yī)院a.婦產(chǎn)科,b.生殖中心,江蘇 無錫214062)

微RNA(microRNA,miRNA)是一類由21~23個核苷酸組成的內(nèi)源性、非編碼、單鏈小分子RNA,通過完全或不完全堿基互補(bǔ)配對原則與特定基因的信使RNA的3'-非翻譯區(qū)或5'-非翻譯區(qū)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平通過對靶信使RNA降解或抑制翻譯過程而發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。1993年,Lee等[1]通過對秀麗新小桿線蟲的研究首先報道了miRNA的存在。2000年,Reinhart等[2]在線蟲發(fā)育調(diào)控的研究中發(fā)現(xiàn)了第2個miRNA——let-7,從而拉開了對miRNA研究的序幕。自miRNA被發(fā)現(xiàn)以來,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)萬種miRNA,這一數(shù)字仍在不斷增加。相信隨著科學(xué)的進(jìn)步,技術(shù)的發(fā)展,越來越多的未知miRNA將會被發(fā)現(xiàn),同時也將會面臨新的挑戰(zhàn)?,F(xiàn)就miRNA的特征及研究進(jìn)展進(jìn)行概述。

1 miRNA簡介

1.1 miRNA的命名 Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(miRBase)是一個提供包含miRNA的序列數(shù)據(jù)、miRNA的命名以及對miRNA靶基因預(yù)測的全方位數(shù)據(jù)庫。作為存儲miRNA信息的權(quán)威數(shù)據(jù)庫,miRBase具有對miRNA基因名稱獨立注冊的權(quán)利。早在miRNA被大規(guī)模發(fā)現(xiàn)的時候,其命名機(jī)制就被確定下來,當(dāng)前已發(fā)展了一套成熟的miRNA命名系統(tǒng)[3]。目前,miRBase已于2014年6月升級至miRBase 21.0版。在該版本中,共收錄28 645個miRNA前體和35 828個成熟體miRNAs,涵蓋了223個物種。相比上一版本(miRBase 20.0版),新版數(shù)據(jù)庫的可靠性進(jìn)一步提升,清除了一些不明確的和錯誤注釋的序列,又有72個條目被清理出數(shù)據(jù)庫。miRNA的命名一般遵循以下基本規(guī)則:(1)miRNA的成熟體通常用miR表示,而miRNA的前體則用mir表示,然后是其物種名稱(采用3~4個字母的縮寫來表示)以及被發(fā)現(xiàn)的時間次序(一般使用阿拉伯?dāng)?shù)字表示,如hsa-miR-200,mmu-miR-200);(2)同源性較高的miRNA在數(shù)字后面加上英文小寫字母(a,b,c,…),如 hsa-miR-200a、hsa-miR-200b 和has-miR-200c;(3)如果一個成熟的miRNA不是由同一條染色體上的DNA序列轉(zhuǎn)錄加工產(chǎn)生,則在后面加上阿拉伯?dāng)?shù)字以區(qū)別(如hsa-miR-16-1和hsa-miR-16-2);(4)若一個miRNA前體的兩個臂可以分別轉(zhuǎn)錄加工成 miRNA,則用“-5p”和“-3p”以區(qū)分,分別表示從該前體的5'端臂和3'端臂加工而來(如 hsa-miR-125a-5p和 has-miR-125a-3p)[3]。以前認(rèn)為,這兩個miRNA表達(dá)水平有差異,將表達(dá)水平較低的miRNA在后面加上*號表示,而表達(dá)水平較高的miRNA后面則不加任何符號。并且一般認(rèn)為miRNA*是沒有功能的,但是有研究報道m(xù)iRNA*其實也是有功能的[4],在某些組織里表達(dá)水平甚至高于miRNA[5]。自miRBase19.0版起,這種 miRNA*命名方式已經(jīng)終止使用。另外,命名規(guī)則確定之前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的miRNA,如lin-4和let-7,則仍使用原來的名字。

1.2 miRNA的生物合成 miRNA的生物合成是一個相當(dāng)復(fù)雜的生物學(xué)過程,它具有多個步驟。首先,在RNA聚合酶Ⅱ的作用下,核內(nèi)編碼miRNA的基因轉(zhuǎn)錄為初級miRNA;隨后,經(jīng)Drosha-DGCR(Drosha-DiGeorge syndrome critical region gene)8復(fù)合物的幫助,初級miRNA被剪接成長為70~80 nt的具有類似發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的miRNA前體;接著,在核質(zhì)(細(xì)胞質(zhì))轉(zhuǎn)運輸出蛋白5的參與作用下,miRNA前體被自細(xì)胞核轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)中;然后,經(jīng)核酸酶Dicer作用,miRNA前體被進(jìn)一步剪切成長度約為22 nt的雙鏈RNA分子;最后,雙鏈RNA分子在解旋酶的酶解作用下,一條鏈被降解,另一條鏈則成為成熟的miRNA,并與Argonaute蛋白一起,與特異的RNA沉默復(fù)合物結(jié)合后形成特異的RNA沉默復(fù)合物-信使RNA復(fù)合物,再按照堿基互補(bǔ)原則與靶信使RNA結(jié)合,從而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮相關(guān)負(fù)性調(diào)控作用。

1.3 miRNA的生物特性

1.3.1 高度的進(jìn)化保守性 目前研究認(rèn)為,成熟的miRNA在物種進(jìn)化過程中具有一定的保守性,人們在低等生物和高等生物基因組中均可以找到同源miRNA,如人和靈長類動物的miRNA之間就有40%的同源基因[6]。miRNA序列結(jié)構(gòu)上的這種高度保守性具有重要的生物學(xué)意義,提示可能在不同生物體的生長發(fā)育過程中,miRNA具有比較一致的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,同時這也為生物進(jìn)化的同源性提供了某種依據(jù),對人們了解物種演變的過程具有非常重要的意義。

1.3.2 表達(dá)的空間特異性 miRNA只在特定的細(xì)胞或組織表達(dá),如miR-124和miR-9在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)高表達(dá),但是兩者仍有區(qū)別,miR-124主要表達(dá)于神經(jīng)前體細(xì)胞中,而miR-9則主要表達(dá)于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中[7-10]。miRNA在不同組織間、細(xì)胞間的差異表達(dá),向人們提示miRNA可能在生物體的組織或細(xì)胞分化過程中發(fā)揮了作用,也對人們理解生物體在正常和疾病狀態(tài)下miRNA表達(dá)的形式和水平的不同有一定的幫助。

1.3.3 表達(dá)的時間特異性 miRNA只在特定的時間或發(fā)育階段表達(dá)。如miR-1和let-7能在成年果蠅中表達(dá),而未能在培養(yǎng)20~24 h的果蠅胚胎細(xì)胞中檢測到[3]。miRNA的表達(dá)呈現(xiàn)出時間發(fā)育特異性,提示miRNA可能參與了生物體個體的發(fā)育過程,并且極有可能在其中發(fā)揮了調(diào)控作用。

1.4 miRNA的功能 miRNA通常位于基因間隔區(qū),但也有部分存在于遺傳編碼基因的內(nèi)含子中[11]。它雖僅占人類基因總數(shù)的2%,卻調(diào)控著人類基因組中30%以上的基因,是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分[12]。miRNA在生物體內(nèi)廣泛存在,對包括生物體的細(xì)胞增殖、分化、凋亡和生物體個體的發(fā)育以及疾病的產(chǎn)生、進(jìn)展及預(yù)后等生命活動均發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)調(diào)控作用,故而對其進(jìn)行深入研究具有非常重要的意義[13-14]。當(dāng)今,miRNA已成為腫瘤研究領(lǐng)域中的熱點。Calin等[15]于2002年最先報道了miRNA在腫瘤發(fā)生中的作用。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)基因組的不穩(wěn)定性是腫瘤的常見特征之一,約50%的miRNA基因位于與腫瘤相關(guān)的染色體的脆性位點上,而且不同類型的腫瘤具有明顯不同的miRNA表達(dá)譜[16]。miRNA具有類似癌基因或抑癌基因的功能,表現(xiàn)為癌基因的活化或抑癌基因的失活,如 Let-7、miR-15、miR-16、miR-34a/b/c、miR-124、miR-143、miR-145、miR-122a等在多種腫瘤中相繼被證實發(fā)揮類似抑癌基因的作用[17-22],而 miR-21、miR-10b、miR-221 和 miR-222 等在多種腫瘤中扮演著類似癌基因的角色[23-26]。

1.5 miRNA的靶基因預(yù)測 由于miRNA的功能與其所調(diào)控的靶基因密切相關(guān),所以研究miRNA的功能必將涉及對miRNA靶基因的鑒定。但是,miRNA對靶基因的調(diào)節(jié)通常并不是一一對應(yīng)的,大多數(shù)情況下,一個miRNA同時對多個靶基因發(fā)揮調(diào)控作用,而一個基因也同時被多個miRNA所調(diào)控;況且生物體具有非常復(fù)雜的內(nèi)在機(jī)制,miRNA的表達(dá)調(diào)控并不是孤立存在的,miRNA對基因的調(diào)節(jié)存在著多種調(diào)控機(jī)制和作用模式,所以,鑒定miRNA靶基因既是這一研究領(lǐng)域的重點,也是該研究領(lǐng)域的難點。生物信息學(xué)的飛速發(fā)展使科學(xué)家們能夠使用特殊的軟件和數(shù)據(jù)庫來預(yù)測miRNA的靶基因[27]。生物信息學(xué)方法主要是基于miRNA和靶基因間的相互作用具有一定的規(guī)律性,通過建立計算模型,整合已有的生物學(xué)數(shù)據(jù),應(yīng)用某種算法或程序來預(yù)測miRNA的靶基因。目前常規(guī)的算法和程序一般遵循以下幾條規(guī)律:①miRNA靶位點在不同物種之間具有保守性;②miRNA與靶基因之間具有互補(bǔ)性;③miRNA與信使RNA相互之間具有熱穩(wěn)定性;④miRNA5'端的結(jié)合能力比3'端的結(jié)合能力強(qiáng)[28]。除了以上這些基本規(guī)則外,不同的算法和程序還會根據(jù)各自總結(jié)的規(guī)律進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。生物信息學(xué)預(yù)測方法的應(yīng)用前景廣闊,使尋找miRNA靶基因有律可循,但是這種方法得出的結(jié)果假陽性率很高;并且運用生物信息學(xué)預(yù)測的miRNA與信使RNA相互作用只是一種理論上的結(jié)合,在不同條件下,miRNA究竟以何種作用形式以及水平存在并不能通過生物信息學(xué)預(yù)測。常用的miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站主要包括,①TargetScan:科學(xué)家在2003年開發(fā)的一款用于預(yù)測哺乳動物miRNA靶基因的軟件,它主要是基于miRNA與信使RNA的堿基互補(bǔ)配對原則,利用miRNA結(jié)構(gòu)序列上的保守性和信使RNA與miRNA相互之間的熱力學(xué)穩(wěn)定性,來預(yù)測miRNA靶目標(biāo),它為人們提供網(wǎng)絡(luò)實時服務(wù),是目前使用頻率最高的miRNA靶基因預(yù)測軟件;②miRbase:該軟件可以通過名稱、關(guān)鍵詞或序列等方式進(jìn)行檢索,并可通過鏈接查詢有關(guān)該miRNA的主要文獻(xiàn),對miRNA進(jìn)行基因組背景分析及靶標(biāo)預(yù)測等;③miRanda:是第一個利用生物信息學(xué)對miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測的軟件,于2003年開發(fā)設(shè)計,應(yīng)用范圍廣,但假陽性率較高;④PicTar:是研究人員通過特定的計算法則來預(yù)測脊椎動物、線蟲、果蠅和人類的非保守但共表達(dá)的miRNA的靶基因,并通過實驗方法進(jìn)行驗證。

1.6 miRNA的靶基因驗證 雖然運用生物信息學(xué)的方法可以為研究人員提供大量的信息,且相對簡單、快速,但是,它只是通過理論上的某種計算為研究人員提供某些參考信息,存在一定的局限性和可靠性,還需要通過生物實驗方法進(jìn)行驗證。最直接的驗證方法是,運用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染miRNA后的細(xì)胞(組織)中信使RNA水平及蛋白水平,從而明確miRNA與靶基因的對應(yīng)關(guān)系。近年來發(fā)展快速的熒光素酶報告基因法由于其快速、靈敏度高以及檢測范圍廣,可以直接驗證miRNA的靶位點。

1.7 miRNA的檢測 目前已有多種方法檢測miRNA,包括基因克隆、Northern blotting、原位雜交、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、微陣列芯片及高通量測序等技術(shù)。目前,大多數(shù)miRNA是通過反轉(zhuǎn)錄克隆識別和鑒定出來的,這是人們發(fā)現(xiàn)miRNA的一個重要方法;Northern blotting是最為經(jīng)典的檢測RNA的手段,也是目前檢測miRNA表達(dá)水平的最主要方法,所有通過克隆和生物信息學(xué)分析得來的miRNA都應(yīng)該經(jīng)過Northern blotting來驗證和鑒定;原位雜交是了解miRNA時間和組織特異性表達(dá)最常用的方法;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)是一種可以定量分析miRNA表達(dá)水平的方式,也可用于驗證生物學(xué)預(yù)測的miRNA;芯片技術(shù)的應(yīng)用實現(xiàn)了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達(dá),分析同一細(xì)胞中不同的miRNA的差異性表達(dá)以及比較不同組織或細(xì)胞中miRNAs表達(dá)譜的差異,成為高通量檢測的最佳選擇;高通量測序能夠在實驗中發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA,成功地檢測到了基因芯片未發(fā)現(xiàn)的miRNA[29]。

2 miRNA的應(yīng)用

由于miRNA在生命活動中表現(xiàn)出來的廣泛調(diào)節(jié)功能以及對基因表達(dá)、生長發(fā)育和疾病發(fā)生、發(fā)展等的復(fù)雜效應(yīng),miRNA自被發(fā)現(xiàn)以來即成為生命科學(xué)的研究熱點。生命科學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代,利用miRNA從分子水平來闡明生物體的生命活動過程,闡述物種的起源和生物的演化,來揭示生命的奧秘?;虮磉_(dá)具有時間和空間的特異性,不同物種、組織、細(xì)胞,在不同生理、病理狀態(tài)下miRNA的表達(dá)情況不同,它們可能會成為用于診斷和(或)區(qū)分健康與疾病狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物[30]。目前,miRNA已經(jīng)作為多種疾病的生物標(biāo)志物[31-33]。此外,理論上,通過改變miRNA的空間結(jié)構(gòu),可以發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點;抑或采用miRNA模擬物、miRNA激動劑、miRNA抑制物以增加或降低病變組織或細(xì)胞的miRNA水平,從而下調(diào)或上調(diào)特異性靶蛋白的表達(dá),開展基于miRNA的分子靶向治療及個體化治療方案[34]。

3 小結(jié)

在過去的研究中,人們已經(jīng)了解了很多關(guān)于miRNA的特性及功能的知識,但對miRNA具有的所有特性和功能還缺乏全面的研究;而miRNA在生物體整體分子網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色的研究才剛剛開始。在未來的研究中,人們將會運用系統(tǒng)生物學(xué)方法來研究miRNA參與控制生物體的生長發(fā)育以及生物體在不同狀態(tài)下的表達(dá)水平,對生物體的生命機(jī)制進(jìn)行全面而系統(tǒng)地分析。相信隨著研究的不斷深入,這些研究成果必將會造福于人類。

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