葉勇，黃秋潔，劉華鋼

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

高效液相色譜法測(cè)定不同來源巖黃連中不同部位脫氫卡維丁含量*

葉勇1，黃秋潔2，劉華鋼1

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001)

目的 建立巖黃連中有效成分脫氫卡維丁的高效液相色譜(HPLC)含量測(cè)定方法，并對(duì)2種不同來源藥材的不同部位進(jìn)行分析，為巖黃連質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。方法 采用SHISEIDO-SPOLAR C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.05 moL·L-1磷酸二氫鈉溶液(25：75)，檢測(cè)波長(zhǎng)347 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃。結(jié)果 脫氫卡維丁進(jìn)樣量在0.024 1～0.482 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好(r=0.999 9)；平均回收率99.48%(RSD=1.44%，n=6)。不同生長(zhǎng)方式的巖黃連脫氫卡維丁的含量差異較大，以野生含量較高；藥材不同部位中以根部含量最高。結(jié)論 建立的脫氫卡維丁含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于巖黃連中類似生物堿成分的質(zhì)量控制。

巖黃連；脫氫卡維丁；色譜法，高效液相

巖黃連系罌粟科紫堇屬植物石生黃堇(CorydalissaxicolaBunting)的全草及肥大的根莖部。收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1990年版第1冊(cè)，因其功效近似黃連且生長(zhǎng)于石縫中或者巖石旁而得名，又叫土黃連、巖連%等[1]。巖黃連味苦，性涼，具有清熱利濕、散瘀消腫功能，臨床主要用于治療肝炎、肝硬化、肝腫瘤和作為輔助治療藥[2-3]。巖黃連含有20多種生物堿成分，其中含量較高且具有明確藥理活性的成分為脫氫卡維丁、脫氫甲卡維丁、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀等[4-7]。巖黃連中生物堿類成分含量測(cè)定的文獻(xiàn)已有報(bào)道[5-6]，其中脫氫卡維丁是巖黃連注射液主要有效成分之一。筆者在本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定巖黃連中脫氫卡維丁含量的方法，并對(duì)不同來源(栽培或野生)巖黃連藥材的不同部位進(jìn)行了定量分析，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：Shimadzu-Prominence HPLC(Shimadzu公司)，包括LC-20A 輸液泵、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱 、LCsolution工作站；XS205DU電子天平(梅特勒-托利多公司)；數(shù)控超聲波清洗器KQ-500DB(昆明市超聲儀器有限公司) 。

1.2 試藥 乙腈為色譜純，磷酸二氫鈉為分析純，水為超純水；脫氫卡維丁對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量>98%，批號(hào)：111667-200401)；巖黃連藥材購(gòu)于廣西壯族自治區(qū)宜州市，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)廖月葵鑒定為巖黃連(Corydalis saxicola Bunting)的全草及根莖部。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：SHISEIDO-SPOLAR C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 moL·L-1磷酸二氫鈉溶液(25：75)；檢測(cè)波長(zhǎng)347 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃，理論板數(shù)按脫氫卡維丁峰計(jì)應(yīng)不得低于3 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取脫氫卡維丁對(duì)照品2.41 mg置于10 mL量瓶中，加入甲醇，超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得每毫升含0.241 mg脫氫卡維丁的對(duì)照品溶液，精密吸取0.241 mg·mL-1脫氫卡維丁對(duì)照品溶液1.0 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.024 1 mg·mL-1脫氫卡維丁對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入1%鹽酸甲醇溶液25 mL，稱質(zhì)量，超聲處理40 min(300 W，40 kHz)，放冷，補(bǔ)重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下，脫氫卡維丁的保留時(shí)間約為12.0 min，分離度>1.5，峰形良好，無雜峰干擾測(cè)定，具有較好的專屬性，分析條件可行。

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0.024 1 mg·mL-1脫氫卡維丁對(duì)照品溶液1，4，8，12，16，20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積積分值(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸。按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積積分值(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3 480 296.2X-5 401.6(r=0.999 9，n=6)。結(jié)果表明，脫氫卡維丁進(jìn)樣量在0.024 1～0.482 0 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取濃度為0.024 1 mg·mL-1脫氫卡維丁對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=0.59%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別于0，2，4，8，10，12 h吸取供試品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD=0.85%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批藥材樣品，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分取上述溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD。計(jì)算各樣品含量，結(jié)果RSD=1.26%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品0.25 g，精密稱定，共6份，每份分別精密加入0.241 0 mg·mL-1脫氫卡維丁對(duì)照品貯備液0.75 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取上述各溶液注入色譜儀，測(cè)定并記錄色譜圖，計(jì)算加樣回收率。計(jì)算各濃度的回收率，結(jié)果平均回收率為99.48%，RSD為1.44%，回收率在97.90%～101.88%之間，結(jié)果見表1。

表1 脫氫卡維丁加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定 精密稱取3批樣品，每批3份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分取上述溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定各批樣品中脫氫卡維丁的含量。不同樣品中脫氫卡維丁的含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 樣品中脫氫卡維丁含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究考察了不同提取溶劑：甲醇、乙醇、1%鹽酸乙醇及1%鹽酸甲醇等，發(fā)現(xiàn)用1%鹽酸甲醇溶液作為溶劑提取脫氫卡維丁含量最高，且提取的樣品中雜質(zhì)干擾較少，分離度、峰形良好，故決定采用1%鹽酸甲醇作為提取溶劑。此外，還考察了加熱回流法、冷浸提取法及超聲法等提取方法，冷浸提取法提取時(shí)間過長(zhǎng)，提取效率低下，且操作繁瑣，加熱回流法與超聲提取法所得提取率結(jié)果差異不明顯，但超聲法提取效率高、快速、雜質(zhì)干擾少、操作簡(jiǎn)單，因此最終選擇超聲提取法，并考察超聲提取20，30，40 和60 min的提取效率，結(jié)果表明超聲提取40 min可獲得較高的提取率，因此確定40 min為超聲提取時(shí)間。

生物堿拖尾比較嚴(yán)重，在流動(dòng)相中加入磷酸二氫鈉等緩沖鹽可改善其峰形，其用量在保證分離度及峰形良好、色譜柱的壽命等前提下越少越好。本實(shí)驗(yàn)通過摸索確定為0.05 moL·L-1，優(yōu)化的洗脫系統(tǒng)能夠較好的對(duì)脫氫卡維丁類生物堿成分進(jìn)行分離，且提取物中其他成分對(duì)分析物沒有干擾。經(jīng)過對(duì)脫氫卡維丁的二極管陣列掃描，發(fā)現(xiàn)有2 個(gè)較大的紫外吸收峰，最強(qiáng)吸收峰在274 nm，次吸收峰在347 nm。但采用274 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，脫氫卡維丁的檢測(cè)受到雜質(zhì)干擾，不能很好分離；選用347 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)無雜質(zhì)干擾，分離度及峰形良好，因而最終選用347 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，野生巖黃連藥材中的脫氫卡維丁含量顯著高于種植藥材，不同生長(zhǎng)方式(野生和種植)巖黃連藥材中不同部位的脫氫卡維丁分布存在一定差異，但野生及種植藥材中均以根部含量最高。本研究采用HPLC法測(cè)定壯族巖黃連中脫氫卡維丁含量，該方法簡(jiǎn)便，快捷、專屬性高，對(duì)巖黃連藥材及其制劑的質(zhì)量控制具有參考意義。

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊(cè))[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001：1523-1524.

[2] 貴州中醫(yī)藥研究院.貴州草藥(第一 集)[M].貴陽(yáng)：貴州人民出版社，1970：609-610.

[3] 廣西衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].南寧：廣西科技出版社，1990：223-224.

[4] 吳穎瑞，馬云寶，趙友興，等.巖黃連的抗乙肝病毒活性成分研究[J].中草藥，2012，43(1)：32-37.

[5] 毛春芹，陸兔林，王靜，等.高效液相色譜法測(cè)定巖黃連總堿膠囊中3種生物堿含量[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46(5)：396-397.

[6] 毛春芹，謝輝，池玉梅，等.高效液相色譜法測(cè)定巖黃連藥材中3種生物堿[J].中成藥，2011，33(8)：1368-1370.

[7]LI H L，ZHANG W D，LIU R H，et al.Simultaneous determination of four active alkaloids from a traditional Chinese medicineCorydalissaxicolaBunting.(Yanhuanglian) in plasma and urine samples by LC-MS-MS[J].J Chromat B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006,831(1-2)：140-146.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.026

Determination of Dehydrocavidine in Different Parts ofCorydalisSaxicolaBunting from Various Origins by HPLC

YE Yong1,HUANG Qiujie2,LIU Huagang1

(1.CollegeofPharmaceuticalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China; 2.CollegeofPharmaceuticalSciences,GuangxiUniversityofTCM，Nanning530001,China)

Objective To establish a quantification method for the determination of dehydrocavidine inCorydalissaxicolaBunting by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC).Different parts of the herb from two different sources were analyzed in order to provide evidence for setting quality standards forCorydalissaxicolaBunting. Methods The samples were separated by RP-HPLC on a SHISEIDO-SPOLAR C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm), with the mixture of acetonitrile and buffer solution of 0.05 moL·L-1sodium dihydrogen phosphate (25：75) as the mobile phase.The detection wavelength was set at 347 nm, and the flowing rate was 1.0 mL·min-1.The column temperature was kept at 30 ℃. Results The linear range of dehydrocavidine was within 0.024 1-0.482 0 μg(r=0.999 9),and the average recovery was 99.48% with RSD of 1.44%(n=6).There was great variation in the content of dehydrocavidine under different growing conditions.Wildly grownCorydalissaxicolaBunting had the highest content of dehydrocavidine, and the roots have the highest content among different parts of the plant. Conclusion The established method is simple, accurate, and reproducible, therefore can be applied to the quality control for analogous alkaloids inCorydalissaxicolaBunting.

CorydalissaxicolaBunting; Dehydrocavidine; Chromatography, high performance liquid

2013-10-14

2014-02-10

*高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(20114503120006)；廣西教育廳科研基金資助項(xiàng)目(201106LX118)

葉勇(1979-)，男，廣西賓陽(yáng)人，講師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。電話：(0)13978679458，E-mail：yong-ye@163.com。

黃秋潔(1979-)，女，廣西賓陽(yáng)人，副教授，碩士，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。電話：(0)13737172226，E-mail：hqj8@163.com。

R282.71；R927.2

B

1004-0781(2015)01-0099-03