賈亮亮，奚煒，彭官良，曾曉，陳進(jìn)兵，金桂蘭

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院·宜昌市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，宜昌 443000)

不同提取工藝對鄂產(chǎn)綠茶多糖體外降糖活性的影響*

賈亮亮，奚煒，彭官良，曾曉，陳進(jìn)兵，金桂蘭

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院·宜昌市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，宜昌 443000)

目的 探討不同提取方法對鄂產(chǎn)綠茶多糖降糖活性的影響。方法 分別采用酶法、熱水提取法、冷水提取法提取鄂產(chǎn)綠茶的茶多糖。 通過體外實(shí)驗(yàn)觀察不同提取方法所得綠茶多糖對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蔗糖酶活性影響，選出對酶抑制作用最強(qiáng)的多糖。結(jié)果 3種提取方法所得綠茶多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用無明顯差別；酶法所提綠茶多糖對α-淀粉酶、蔗糖酶活性強(qiáng)于熱水提取法、冷水提取法所得的綠茶多糖。結(jié)論 酶法提取的綠茶多糖具有較好的體外降血糖活性。

綠茶多糖；提取工藝；降糖活性

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，是繼心血管疾病及腫瘤之后的第三大疾病。因糖尿病引發(fā)的心、腦、腎、眼、神經(jīng)等并發(fā)癥給患者身心造成巨大痛苦。我國及日本民間一直流傳用泡飲茶葉輔助治療糖尿病[1]。文獻(xiàn)也報道茶多糖具有降低血糖的作用[2-3]。茶多糖是一種具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的大分子化合物，產(chǎn)地、品種、提取分離方法等因素都會影響其空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其生物活性，這些不確定的因素極大制約了茶多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用。筆者利用湖北省宜昌市茶葉資源豐富的特點(diǎn)，通過評價不同提取方式對茶多糖體外降糖活性的影響，篩選出具有最優(yōu)降糖活性的茶多糖的提取工藝，為鄂產(chǎn)茶葉的多元化開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試劑 綠茶購自湖北省宜昌市，經(jīng)三峽大學(xué)湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室汪鋆植副教授鑒定為山茶科山茶屬植物鄂產(chǎn)綠茶(Camelliasinensis)。經(jīng)粉碎后過篩孔內(nèi)徑0.25 mm(60目)篩備用；α-葡萄糖苷酶(批號：0009001427)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenol β-D-glucoside，PNP-G)(批號：000376-7280)、蔗糖酶(批號：0009001574)均購自Sigma公司；阿卡波糖(批號：BJ00347)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；纖維素酶(批號：20120427)、α-淀粉酶(批號：20120514)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 TYPE1500-458全波長型酶標(biāo)儀(美國Thermo Electron公司)；單道移液器(法國Gilson公司)；96孔酶標(biāo)板(德國 Greiner公司)。WFZ UV-2100型紫外-可見分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]；LD4-4型落地式低速大容量離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RetschZM100型粉碎機(jī)[德國Retsch(萊馳)有限公司]。

1.3 茶葉原料的處理 綠茶350 g，磨碎后用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇3 000 mL提取2 h，提取2次除去茶葉中的色素、多酚類等脂溶性雜質(zhì)，回收乙醇，茶渣自然風(fēng)干后備用。

1.4 不同提取方法

1.4.1 熱水提取茶多糖 取“1.3”項(xiàng)下處理過的茶渣90 g，沸水提取2次，料液比分別為1：10，1：8，時間均為2 h，3 500 r·min-1離心15 min，合并2次上清液，濃縮至750 mL，加入3倍體積的95%乙醇沉淀(測得溶液的終濃度為80%)，低溫靜置過夜，3 500 r·min-1離心15 min，沉淀揮發(fā)去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3體積的Sevag試劑(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室溫下攪拌30 min，靜置2 h，取上層水相，3 500 r·min-1離心15 min，取上清液，重復(fù)4次，60 ℃真空干燥。

1.4.2 冷水提取茶多糖 取“1.3”項(xiàng)下處理過的茶渣90 g，冷水電磁攪拌提取3.5 h，料液比為1：10，加入3倍體積的 95%乙醇沉淀(測得溶液的終濃度為80%)，低溫靜置過夜，3 500 r·min-1離心15 min，沉淀揮發(fā)去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3體積的Sevag試劑(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室溫下攪拌30 min，靜置2 h，取上層水相，3 500 r·min-1離心15 min，取上清液，重復(fù)4次，60 ℃真空干燥。

1.4.3 酶法提取茶多糖 取“1.3”項(xiàng)下處理過的茶渣90 g，茶渣與水的質(zhì)量比1：10，溫度 45 ℃，pH 4.5，加0.5%纖維素酶量，提取 120 min，濃縮濾液，加入3倍體積的 95%乙醇沉淀(測得溶液的終濃度為80%)，低溫靜置過夜，3 500 r·min-1離心15 min，沉淀揮發(fā)去多余乙醇后，加水溶解到400 mL，加入1/3體積的Sevag試劑(三氯甲烷溶液：正丁醇=4：1)，室溫下攪拌30 min，置分液漏斗中靜置2 h，取上層水相，3 500 r·min-1離心15 min，取上清液，重復(fù)4次，60 ℃真空干燥。

1.5 綠茶多糖含量的測定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的分析純葡萄糖500 mg，精密稱定，溶于純化水，定容至500 mL，分別吸取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0 mL置25 mL量瓶中，以純化水定容，吸取葡萄糖稀釋液1.0 mL，置于具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻5 min后，放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸10 min取出，自來水冷卻。室溫放置10 min，以波長610 nm測吸光度(A)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：Y=0.076X+0.012 4，R2=0.992。 線性范圍為40～160 μg·mL-1。

1.5.2 總糖含量的測定 取熱水提取物、冷水提取物、酶法提取物各12.5 mg，分別置于10 mL量瓶，加水溶解并定容。分別取葡萄糖溶液0.5 mL置于具塞試管中，加入0.2%蒽酮試劑4.0 mL，迅速浸于冰水浴中冷卻5 min后，放入熱水浴中，管口加蓋玻璃塞，以防蒸發(fā)，準(zhǔn)確煮沸 10 min取出，自來水冷卻。室溫放置 10 min，以波長610 nm測定A值。

1.6 不同提取方法所得綠茶多糖體外對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蔗糖酶活性影響

1.6.1 對α-葡萄糖苷酶活性的影響 根據(jù)馬繼雄等[4]介紹的方法，α-葡萄糖苷酶在37 ℃條件下可以水解其底物對硝基酚-葡萄糖，產(chǎn)生對硝基酚，以水解20 min內(nèi)反應(yīng)體系中對硝基酚的生成量來計算茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

反應(yīng)體系：取67 mmol·L-1、pH=6.8磷酸鉀緩沖液250 μL，10 mmol·L-1對硝基酚-葡萄糖溶液50 μL，分別加入的質(zhì)量濃度為0.312，0.625，1.250，2.500，5.000 mg·mL-1各組多糖提取物50 μL 和0.1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶50 μL，混勻后置于37 ℃水浴孵育20 min，然后加入1 mol·L-1碳酸鈉溶液100 μL終止反應(yīng)。每組中用純化水代替酶液作為空白對照，阿卡波糖作為陽性對照。將反應(yīng)液置于全波長型酶標(biāo)儀中，在波長405 nm下測各孔A值。

按照抑制率的定義，樣品提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按照下式計算：抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%。式中：A1為酶與底物反應(yīng)后的吸光度，A2為加入抑制劑后酶反應(yīng)的吸光度。

1.6.2 對α-淀粉酶活性的影響 酶活性的定義：一個單位的抑制劑活力定義為在上述條件下每毫升抑制劑溶液在每分鐘內(nèi)抑制α-淀粉酶消耗淀粉的量(mg)[5]。根據(jù)抑制活力的定義，需要建立A值與淀粉濃度之間的方程式。配制不同濃度的淀粉溶液，分別取淀粉溶液0.5 mL，加2 mol·L-1鹽酸0.3 mL，純化水4.0 mL，加0.01 mol·L-1碘溶液0.2 mL顯色，在600 nm波長處測定A值。以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程：Y=1.083 3X+0.089 6，R2=0.998，線性范圍為：0.16～0.72 mg·mL-1。

取0.1 U·mL-1α-淀粉酶0.3 mL和質(zhì)量濃度為0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mg·mL-1各組綠茶多糖溶液0.7 mL于試管中，在37 ℃條件下預(yù)反應(yīng)30 min后，加入0.4 mg·mL-1淀粉溶液0.5 mL再反應(yīng)15 min，用2 mol·L-1鹽酸0.3 mL中止反應(yīng)，加純化水使各管溶液終體積為4.8 mL，加0.01 mol·mL-1碘溶液0.2 mL顯色，在600 nm處測定A值。每個樣品在同一濃度下做3個平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。阿卡波糖作為本法的陽性對照，同時設(shè)定空白對照和陰性對照。

酶活性抑制率(%)=(A1-A2)-0.089 6)/1.083 3n×100%

式中：A1為加入抑制劑后酶反應(yīng)的吸光度，A2為酶與底物反應(yīng)后的吸光度，n為加入抑制劑體積(mL)。

1.6.3 對蔗糖酶活性的影響 用pH=4.5的醋酸鈉溶液配制10 mg·mL-1蔗糖溶液，取蔗糖溶液0.9 mL，分別加入各組綠茶多糖溶液0.5 mL，混勻，55 ℃水浴5 min。水浴后各管加入1.5 U·mL-1蔗糖酶0.1 mL，55 ℃水浴20 min，采用葡萄糖氧化酶法，在505 nm波長下測定A值，以葡萄糖的生成量計算蔗糖酶抑制活性，阿卡波糖作為本法的陽性對照，同時設(shè)定空白對照。

抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%

式中：A1為酶與底物反應(yīng)后的吸光度，A2為加入抑制劑后酶反應(yīng)的吸光度。

2 結(jié)果

2.1 不同提取方法對茶多糖提取率的影響 沸水提取、酶提取和冷水提取所得多糖含量分別為2.58%，1.59%，0.86%?？梢?，3種提取方法中沸水提取所得多糖的得率最高，其次為酶提取法，得率最低為冷水提取法。

2.2 不同提取方法所得茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響 見圖1。3種提取方法所得綠茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均較低，抑制率均<20%。且3種提取方法所得茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用無明顯差異，表明綠茶多糖降血糖作用與抑制α-葡萄糖苷酶活性無關(guān)。

2.3 不同提取方法所得茶多糖對α-淀粉酶活性的影響 見圖2。3種提取方法中，酶提取法所得茶多糖對α-淀粉酶活性抑制作用強(qiáng)于熱水提取及冷水提取法，其原因可能與酶解法條件溫和，對茶多糖天然空間結(jié)構(gòu)破壞較小，較好保留了茶多糖生物活性有關(guān)。

2.4 不同提取方法所得茶多糖對蔗糖酶活性的影響 見圖3。3種提取方法中，酶提取法所得茶多糖對蔗糖酶活性抑制作用強(qiáng)于熱水提取法及冷水提取法，其原因可能與酶提取法作用溫和、對茶多糖天然空間結(jié)構(gòu)破壞較小、較好地保留了茶多糖的生物活性有關(guān) 。

3 討論

多糖屬于極性大分子化合物，通常選擇水作為溶劑進(jìn)行提取，可以用熱水浸煮提取，也可用冷水浸提[6]。溶劑提取為常用的傳統(tǒng)方法之一，成本低，不需特殊設(shè)備，但是其提取效率較低，影響其進(jìn)一步推廣。酶工程技術(shù)是近年來用于天然植物有效成分提取的一項(xiàng)生物工程技術(shù)。選用恰當(dāng)?shù)拿福奢^溫和地將植物組織分解，加速有效成分的釋放，從而提高其提取率[7]。并且其作用條件溫和，可最大程度地保持多糖分子的空間構(gòu)型，從而保證多糖的生物活性不發(fā)生改變[8]。

圖1 3種提取方法所得茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

Fig.1 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on α-glucosidase activity

圖2 3種提取方法所得茶多糖對α-淀粉酶活性的影響

Fig.2 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on α-amylase activity

圖3 3種提取方法所得茶多糖對蔗糖酶活性的影響

Fig.3 Effect of tea polysaccharide extracted by three methods on invertase activity

α-葡萄糖苷酶位于小腸刷狀緣膜上皮細(xì)胞，能將雙糖水解成可被小腸吸收的單糖，是食物中碳水化合物水解的關(guān)鍵酶。因此，抑制該酶能夠延緩碳水化合物的消化，減少葡萄糖吸收入血，進(jìn)而抑制餐后高血糖[9-11]。 α-淀粉酶抑制劑屬于糖(苷)水解酶抑制劑，能有效地抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量，進(jìn)食后不產(chǎn)生高血糖癥，從而使胰島素分泌減少，脂肪合成降低，體質(zhì)量減輕。α-淀粉酶抑制劑目前在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的用途，臨床上用于防治糖尿病、 高血糖、 高血脂等[12]，其在體內(nèi)對胰腺或唾液中的α-淀粉酶有很強(qiáng)的抑制作用，并能降低血糖和血脂的濃度[13-14]。蔗糖酶是小腸內(nèi)重要的雙糖酶，主要存在于小腸絨毛頂端，由小腸絨毛上皮細(xì)胞合成分泌，水解蔗糖生成葡萄糖和果糖，對小腸消化及吸收功能具有重要意義[15]。許多藥物降血糖的機(jī)制與抑制腸道內(nèi)蔗糖酶活性有關(guān)[16-17]。因此，筆者觀察不同提取方法所得綠茶多糖對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶及蔗糖酶的活性的影響，以便篩選出降糖活性最強(qiáng)的一組綠茶多糖。

本研究結(jié)果顯示，鄂產(chǎn)綠茶多糖對α-葡萄糖苷酶活性影響較小，且3種提取方法所得茶多糖在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面沒有明顯差異；而酶法提取的綠茶多糖對α-淀粉酶和蔗糖酶活性的抑制作用優(yōu)于水溶劑提取法，其原因可能是酶提取方法較溫和，對多糖空間結(jié)構(gòu)的破壞較小，最大程度保留了鄂產(chǎn)綠茶多糖的活性。冷水浸提法雖然條件亦溫和，但是多糖的浸出效率太低，短時間內(nèi)無法使盡可能多的不同相對分子質(zhì)量、不同酸堿性的多糖被提取出來，有活性的多糖分子相對較少，從而使其對α-淀粉酶和蔗糖酶活性的抑制作用弱于酶提取法所得的茶多糖。

茶多糖調(diào)節(jié)血糖的作用近年來被廣泛研究，但是茶多糖來源、品種、提取方法等因素對其降血糖作用的影響方面的研究較少。筆者研究了不同提取工藝對鄂產(chǎn)綠茶多糖降血糖作用的影響，以期為鄂產(chǎn)綠茶進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論支持。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.002

Influence of Different Extraction Technologies on Hypoglycemic Activity ofHubeiGreen Tea PolysaccharideinVitro

JIA Liangliang,XI Wei,PENG Guanliang,ZENG Xiao,CHEN Jinbing,JIN Guilan

(DepartmentofPharmacy,People'sHospitalofSanxiaUniversity,theFirstPeople'sHospitalofYichang,Yichang443000,China)

Objective To investigate the influence of different extraction methods on hypoglycemic activities of polysaccharides fromHubeigreen tea. Methods Different green tea polysaccharides were extracted by enzymatic extraction, hot water extraction or cold water extraction, respectively.The inhibitory activities of the extract on α-glucosidase, α-amylase and invertaseinvitrowere investigated to determine the most efficient extraction technique. Results There was no significant difference in the inhibition of α-glucosidase by polysaccharides from three different extractions.The polysaccharides extracted by enzyme method were more active on α-amylase and invertase than those extracted from hot water and cold water methods. Conclusion The green tea polysaccharides extracted by enzyme method showed better hypoglycemic activityinvitro.

Green tea polysaccharide; Extraction technology; Hypoglycemic activity

2013-10-14

2014-02-12

*宜昌市科技研究與開發(fā)項(xiàng)目(A12301-21)

賈亮亮(1985-)，男，山西原平人，藥師，碩士，主要從事中藥藥理學(xué)及臨床藥學(xué)研究。電話：0717-6221372，E-mail：jialiang822@163.com。

金桂蘭(1968-)，女，湖北宜昌人，主任藥師，碩士，主要從事醫(yī)院藥學(xué)及藥物制劑學(xué)研究。電話：0717-6228045，E-mail：jin_gl@163.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)01-0007-04