楊鵬，侯俊，徐青果，陳春，湯和青，柯齊斌

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科，宜昌 443003)

右美托咪定對膿毒癥肺損傷大鼠的保護(hù)作用

楊鵬，侯俊，徐青果，陳春，湯和青，柯齊斌

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院麻醉科，宜昌 443003)

目的 探討右美托咪定(Dex)對膿毒癥肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為4組，每組25只。Ⅰ組為假手術(shù)組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立膿毒癥模型。Ⅱ組為模型對照組；Ⅲ組分別于CLP手術(shù)后0，2，4，6 h腹腔注射Dex 12.5 μg·kg-1；Ⅳ組分別于CLP手術(shù)后0，2，4，6 h腹腔注射Dex 25.0 μg·kg-1。CLP手術(shù)后0，2，4，6，24 h分別測定肺組織腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6濃度，CLP后24 h酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定肺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)水平，Western blot測定肺組織Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)，檢測肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)，蘇木精-伊紅染色觀察肺組織的病理變化。結(jié)果 與Ⅱ組比較，Ⅲ組和Ⅳ組中肺組織TNF-α、IL-6及HMGB1水平明顯降低(P<0.05)，肺組織TLR4表達(dá)及W/D明顯降低，病理學(xué)損傷也明顯減輕(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 Dex抑制炎癥反應(yīng)從而減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，其機(jī)制可能通過抑制TLR4通路來實(shí)現(xiàn)。

右美托咪定；膿毒癥；損傷，肺；炎癥反應(yīng)

膿毒癥是由感染或可疑感染灶引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，病情兇險(xiǎn)，死亡率高。肺組織是膿毒癥過程中最易受損的器官之一，其超強(qiáng)的炎癥反應(yīng)被視為主要的病理生理改變[1]。研究證實(shí)Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導(dǎo)膿毒癥導(dǎo)致急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[2-3]。高遷移率族蛋白B1(high-modility group box 1，HMGB1)在膿毒癥和失血性休克中和ALI的發(fā)生率密切相關(guān)，能通過相關(guān)途徑來激活TLR4[4]。針對HMGB1的靶向調(diào)控是近年來治療感染性和損傷性炎癥反應(yīng)的新策略[5]。α2腎上腺素受體激動(dòng)藥右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)可以降低全身炎癥反應(yīng)從而延長生存時(shí)間[6-7]。然而Dex調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的具體作用機(jī)制尚不明確。筆者通過建立大鼠膿毒癥模型，探討Dex對膿毒癥肺損傷大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級大鼠100只，體質(zhì)量250～300 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[合格證號：SCXK(鄂)2008-0004]，使用許可證號：SCXK(鄂)2010-2012。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度21～25 ℃，濕度50%～60%。

1.2 試劑 大鼠腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(日本IBL，批號：27194)，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和HMGB1試劑盒(海博谷生物科技有限公司，批號分別為REI020和REH002)，Western blot測定肺組織TLR4(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-1021R)。Dex注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份公司，批號：12081024)。

1.3 模型制備與分組 大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(n=25)：Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)建立大鼠膿毒癥模型[8]。大鼠給予10%水合氯醛3.5×10-3mL·g-1腹腔注射麻醉，備皮消毒。于腹正中切開1 cm切口，1號絲線結(jié)扎1/2盲腸，以20G針頭在游離端對穿1次后送回腹腔，之后分離縫合肌層及皮膚，以浸潤0.9%氯化鈉溶液的紗布覆蓋切口處，減少切口處體液蒸發(fā)。Ⅰ組僅行開腹不行盲腸結(jié)扎穿孔，其他組行GLP建模，大鼠活動(dòng)減少，嗜睡，出現(xiàn)呼吸困難，表明造模成功。Ⅲ、Ⅳ組于CLP后0，2，4，6 h分別腹腔注射Dex 12.5，25.0 μg·kg-1。Ⅰ、Ⅱ組于相同時(shí)間點(diǎn)注射等體積0.9%氯化鈉溶液。分別于CLP后0，2，4，6，24 h處死各亞組動(dòng)物并取標(biāo)本，每個(gè)亞組標(biāo)本5份。CLP后24 h取出右肺后拭干表面血液，用天平稱其質(zhì)量即為濕質(zhì)量，放入80 ℃烤箱烘烤48 h后，再次稱其質(zhì)量，即為干質(zhì)量。計(jì)算濕干質(zhì)量比例(W/D)。左肺上端儲存-80 ℃液氮中行Western blot測定肺組織TLR4表達(dá)，下肺組織行蘇木精-伊紅染色觀察肺組織的病理變化。肺損傷的病理評估方法參照OZDULGER等[9]的研究，1 分：無損傷，正常肺組織結(jié)構(gòu)；2 分：輕度損傷，輕度的肺間質(zhì)充血和中性粒細(xì)胞浸潤；3分：中度損傷，血管周圍水腫形成，肺組織結(jié)構(gòu)部分破壞并伴中度的中性粒細(xì)胞浸潤；4 分：嚴(yán)重?fù)p傷，肺組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，大量中性粒細(xì)胞浸潤。各時(shí)間點(diǎn)取肺組織于4 ℃勻漿，離心15 min后取上清液于-80 ℃保存，ELISA法測定肺組織TNF-α、IL-6濃度和HMGB1水平。

2 結(jié)果

2.1 肺組織TNF-α和IL-6濃度比較 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺組織TNF-α和IL-6濃度在CLP后逐漸升高。Ⅲ、Ⅳ組TNF-α濃度在CLP 2，4及24 h較Ⅱ組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅲ、Ⅳ組IL-6濃度在CLP 2，4，6，24 h均較Ⅱ組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，2。

2.2 TLR4表達(dá)比較 Ⅱ組TLR4蛋白表達(dá)較Ⅰ組顯著升高，經(jīng)Dex干預(yù)后，Ⅲ、Ⅳ組TLR4蛋白表達(dá)較Ⅱ組明顯降低。見圖1。

表1 4組大鼠肺組織TNF-α濃度比較

Tab.1 Comparison of TNF-α level in lung tissue among four groups of rats

與Ⅰ組比較，*1P<0.01；與Ⅱ組比較，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.01；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

表2 4組大鼠肺組織IL-6濃度比較

Tab.2 Comparison of IL-6 level in lung tissue among four groups of rats

與Ⅰ組比較，*1P<0.01；與Ⅱ組比較，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.01；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

Fig.1 TLR4 expression in lung tissue of four groups of rats

2.3 CLP 24 h各組肺組織HMGB1濃度、 W/D和肺組織損傷評分比較 CLP 24 hⅢ、Ⅳ組肺組織HMGB1濃度、 W/D和肺組織損傷評分較Ⅱ組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。顯微鏡下見Ⅱ組肺間質(zhì)細(xì)胞增多，肺泡腔縮窄，大量炎性細(xì)胞聚集。Ⅲ、Ⅳ組肺泡腔完整，炎性細(xì)胞少。見圖2。

表3 4組大鼠肺組織HMGB1、W/D和肺損傷評分比較

與Ⅰ組比較，*1P<0.05；與Ⅱ組比較，*2P<0.05

Compared with group Ⅰ，*1P<0.05；compared with group Ⅱ，*2P<0.05

3 討論

強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)被視為膿毒癥重要的病理生理過程[10]。膿毒癥的動(dòng)物模型目前有兩種：脂多糖誘導(dǎo)和CLP。筆者采用CLP建模后，大鼠活動(dòng)減少，嗜睡，出現(xiàn)呼吸困難，證實(shí)造模成功。Dex作為高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)藥，可減少膿毒癥時(shí)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α和IL-6，在膿毒癥時(shí)產(chǎn)生器官保護(hù)作用[11-12]。TANIGUCHI等[13]實(shí)驗(yàn)證實(shí)Dex可抑制動(dòng)物膿毒癥休克的炎癥反應(yīng)并降低死亡率，其效應(yīng)具有劑量和時(shí)間相關(guān)性。LAI等[14]觀察到大劑量Dex(約10倍臨床劑量)可明顯抑制膿毒癥大鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子和細(xì)胞分子表達(dá)的上調(diào)。Dex分布半衰期為6 min，清除半衰期為2 h，故選擇12.5和25.0 μg·kg-1兩個(gè)劑量多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后處理，發(fā)現(xiàn)Dex兩個(gè)劑量均能顯著降低TNF-α和IL-6的表達(dá)，明顯減輕肺組織損傷，產(chǎn)生效應(yīng)無明顯差異。

膿毒癥導(dǎo)致的ALI，包括產(chǎn)生大量促炎癥因子和炎癥細(xì)胞浸潤，這些都是導(dǎo)致死亡的重要因素。因此減輕炎癥反應(yīng)是降低膿毒癥死亡率的重要方法。TNF-α和IL-6是炎癥中重要的啟動(dòng)因子，是導(dǎo)致肺損傷最早釋放的細(xì)胞因子。HMGB1是一種重要的晚期炎癥因子，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：兩個(gè)同源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(A框和B框)與C末端。其中B框是HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞因子的部分，刺激中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α等致炎癥細(xì)胞因子[15]。細(xì)胞一旦受損傷，膜結(jié)構(gòu)遭受破壞，HMGB1會(huì)以單純擴(kuò)散的方式釋放HMGB1，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。凋亡或壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放HMGB1，啟動(dòng)早期炎癥應(yīng)答，及時(shí)清除異物對損傷組織或器官起到修復(fù)作用；單核巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及神經(jīng)元主動(dòng)分泌HMGB1，作為促炎癥細(xì)胞因子樣物質(zhì)，啟動(dòng)晚期炎癥應(yīng)答。在趨化因子的作用下，使更多的炎癥細(xì)胞浸潤到受損的組織，病理損傷進(jìn)一步加重。DENG等[2]研究表明HMGB1激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子導(dǎo)致ALI。TLR4是TLR家族中跨細(xì)胞膜受體蛋白的重要成員之一，主要在內(nèi)皮細(xì)胞以及包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的表面表達(dá)，在脂多糖信號識別中起重要作用。TLR4能夠通過髓樣分化蛋白88來介導(dǎo)核因子-κB的激活，增加TNF-α和IL-6生成。HMGB1受體主要分為兩大類，一類是晚期糖化終產(chǎn)物受體，另一類是TLR。HMGB1主要與TLR2、TLR4兩種受體結(jié)合，結(jié)合后通過活化髓樣分化蛋白88、IL-1受體相關(guān)激酶以及腫瘤壞死因子受體活化因子-6，最終導(dǎo)致核因子-κB的活化和轉(zhuǎn)錄進(jìn)核，生成和釋放促炎細(xì)胞因子，激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)[16]。本研究表明，Dex下調(diào)CLP后的HMGB1的表達(dá)，下調(diào)的HMGB1減少TNF-α和IL-6生成；TLR4表達(dá)下調(diào)同樣減少炎癥細(xì)胞因子的生成，同時(shí)下調(diào)HMGB1和TLR4結(jié)合，進(jìn)一步減少促炎癥因子，減輕肺組織的損傷。本研究僅局限于CLP后24 h，在今后研究中需對膿毒癥整個(gè)過程跟蹤觀測。

總之，Dex可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕膿毒癥大鼠的肺損傷，其機(jī)制可能通過抑制TLR4通路來實(shí)現(xiàn)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.005

Protective Effect of Dexmedetomidine on Acute Lung Injury Induced Sepsis in Rats

YANG Peng,HOU Jun,XU Qingguo,CHEN Chun,TANG Heqing,KE Qibin

(DepartmentofAnesthesiology,theFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ThreeGorgesUniversity,Yichang443003,China)

Objective To investigate the protective effect of dexmedetomidine (Dex) on septic lung injury in rats. Methods One hundred male SD rats were randomly divided into four groups (n=25 in each group).Group Ⅰ was treated with sham operation only.Groups Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳ

cecal ligation and puncture (CLP) to create the sepsis model.Group Ⅱ served as model control, group Ⅲ and Ⅳ received intraperitoneal injections of Dex at 12.5 and 25.0 μg·kg-1, respectively, at 0,2,4,and 6 hours after CLP.TNF-α and IL-6 in lung tissue were measured at 0,2,4,6, and 24 h.ELISA was used to detect the levels of HMGB1, TNF-α and IL-6 at 24 h.The expression of TLR4 protein was assessed by western blotting.The acute lung injury was detected by HE stain and W/D ratio. Results In groups Ⅲ and Ⅳ, the expressions of TNF-α and IL-6 were decreased significantly compared with group Ⅱ(P<0.05).The expression of TLR4 in lung tissue and W/D ratio were decreased in groups Ⅲ and Ⅳ compared with group Ⅱ(P<0.05).There was no significant difference between group Ⅲ and Ⅳ. Conclusion Dexmedetomidine can attenuate lung inflammatory reaction and lung injury in septic rats, the mechanism of which may be related to suppression of TLR4 pathway.

Dexmedetomidine; Septic; Injury, lung; Inflammatory reaction

2013-09-06

2014-03-06

楊鵬(1982-)，男，湖北荊州人，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：臨床麻醉和器官保護(hù)。電話：(0)15997516957，E-mail：88452338@qq.com。

侯俊(1969-)，男，湖北荊州人，副主任醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：小兒麻醉和器官保護(hù)。電話：(0)15871598615，E-mail：houjun691218@126.com。

R971.2；R965

A

1004-0781(2015)01-0022-04