張珺，程月發(fā)，張愛兵

(1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，唐山 063300；2.河北省唐山市藥品檢驗(yàn)所，唐山 063000)

丹參膠囊水溶性成分的高效液相色譜指紋圖譜分析*

張珺1，程月發(fā)1，張愛兵2

(1.河北聯(lián)合大學(xué)冀唐學(xué)院，唐山 063300；2.河北省唐山市藥品檢驗(yàn)所，唐山 063000)

目的 建立丹參膠囊水溶性成分的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜。方法 利用HPLC法分析丹參膠囊的水溶性成分，色譜柱為Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇-乙腈-磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長286 nm，柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1。結(jié)果 確定兩個(gè)廠家丹參膠囊水溶性成分HPLC指紋圖譜中的共有峰分別為9和22個(gè)，建立了兩個(gè)廠家丹參膠囊水溶性成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。結(jié)論 建立的丹參膠囊水溶性成分的HPLC指紋圖譜重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可適用于丹參膠囊水溶性成分的質(zhì)量控制。

丹參膠囊；成分，水溶性；色譜法，高效液相；指紋圖譜

丹參膠囊為市售常用中成藥，其藥效成分主要可分為水溶性的酚酸類成分和脂溶性的二萜醌類成分。其中水溶性的成分主要有丹參素、原兒茶醛、丹酚酸A和丹酚酸B等，具有抗心肌缺血、增加冠狀動(dòng)脈血流量和清除自由基等作用[1-3]。目前較多研究集中在建立丹參藥材及其制劑水溶性成分的指紋圖譜[4-5]，但對(duì)丹參膠囊水溶性成分的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜研究筆者尚未見報(bào)道。筆者通過建立丹參膠囊水溶性成分的HPLC指紋圖譜，以期為丹參膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供更好的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100型系列高效液相色譜儀(美國Agilent公司)包括G1311A四元梯度泵，G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱和G1315B檢測器；Chem StationRev.A10.02色譜工作站；BP211D電子天平(德國Sartorius公司)；SB2200超聲波清洗機(jī)(上海Branson公司，頻率50HZ)。

1.2 試藥 丹參膠囊(西雙版納雨林制藥有限責(zé)任公司，簡稱雨林公司，批號(hào)：100526，100701，100910，120526，120527，120721，120722，120820，120821，121103，121104，121105)；海南賽立克藥業(yè)有限公司(簡稱賽立克公司)的丹參膠囊(批號(hào)：090802，100101，100901，111204，120305，120904，120905，121201，130101，130304)均市售購得。原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)：813-9201)購自中國食品藥品檢定研究院；丹參素(批號(hào)：22681-72-7)、迷迭香酸(批號(hào)：20283-92-5)、丹酚酸 B(批號(hào)：115939-25-8)和丹酚酸A(批號(hào)：96574-01-5)對(duì)照品均購自貴州迪大生物有限公司，純度>98%；甲醇和乙腈均為色譜純；磷酸為分析純；水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Thermo Syncronis C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A為甲醇，B為乙腈，C為0.02%磷酸溶液；梯度洗脫，流動(dòng)相比例見表1；柱溫：30 ℃；流速1 mL·min-1；檢測波長286 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫中流動(dòng)相的比例

2.2 混合對(duì)照品、樣品及陰性對(duì)照液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品的制備 分別精密稱取丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A 1.18，0.88，0.61，5.67 和0.42 mg置5 mL棕色量瓶中，加去離子水溶解并定容，配成濃度分別為236，176，122，1 134和84 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 取丹參膠囊20粒，精密稱定，研磨成粉末，精密稱取0.30 g置于具塞錐形瓶中，精密加入去離子水20 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，再稱定總量，用去離子水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，溶液過孔徑0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照液的制備 分別按丹參膠囊的生產(chǎn)工藝制備缺丹參的陰性制劑，并按照樣品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取賽立克公司批號(hào)為130101的丹參膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)方法制得樣品溶液，置于避光密閉容器。按本實(shí)驗(yàn)色譜條件，分別于0，2，4，8，12和24 h進(jìn)行測定并記錄色譜圖，計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均<3%。說明樣品溶液在避光密閉容器中24 h內(nèi)含量變化不大，比較穩(wěn)定。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取賽立克公司批號(hào)為130101的丹參膠囊，按本實(shí)驗(yàn)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果RSD均<2%。符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的相關(guān)規(guī)定。

2.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取賽立克公司批號(hào)為130101的丹參膠囊，按“2.2.2”項(xiàng)方法分別平行制備6份樣品溶液，按實(shí)驗(yàn)色譜條件記錄丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均<3%。符合《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》的相關(guān)規(guī)定。表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 丹參膠囊水溶性成分HPLC指紋圖譜的建立 對(duì)兩個(gè)廠家共22批次丹參膠囊樣品進(jìn)行了測定，其中雨林公司的丹參膠囊HPLC圖譜中共有42個(gè)峰，其指紋圖譜中共有9個(gè)共有峰，見圖1A，其中2號(hào)、5號(hào)和7號(hào)峰分別為丹參素、迷迭香酸和丹酚酸B(與對(duì)照品對(duì)照確認(rèn)，見圖1C)，但在共有峰中并未出現(xiàn)原兒茶醛和丹酚酸A的色譜峰。賽立克公司的丹參膠囊指紋圖譜中共有89個(gè)峰，其指紋圖譜中共有22個(gè)共有峰，4號(hào)、5號(hào)、16號(hào)和18號(hào)分別為丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B(與對(duì)照品對(duì)照確認(rèn)，見圖1C)，見圖1B，但在共有峰中并未出現(xiàn)丹酚酸A的色譜峰?；旌蠈?duì)照品圖譜見圖1C。兩個(gè)廠家的HPLC指紋圖譜見圖2。陰性對(duì)照品HPLC圖見圖3。

A.丹參膠囊樣品(雨林公司)；B.丹參膠囊樣品(賽立克公司)；C.混合對(duì)照品色譜圖；1.丹參素；2.原兒茶醛；3.迷迭香酸；4.丹酚酸B；5.丹酚酸A

圖1 丹參膠囊樣品及混合對(duì)照品色譜圖

A.danshencapsule(yulincompany)；B.danshencapsule(sailikecompany)；C.mixture of standards；1.danshendu；2.protocatechuic aldehyde；3.rosmarinc acid；4.salvianolic B；5.salvianolic A

Fig.1 Chromatogram ofdanshencapsule and mixture of reference substance

分別選擇圖1B中的4號(hào)峰[4(s)]和1A中的2號(hào)峰[2(s)]作為各自指紋圖譜中的參照峰，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)比，該峰為丹參素的色譜峰，由于丹參素在丹參膠囊中含量穩(wěn)定，在色譜圖中分離度較好且易辨認(rèn)，因此選擇丹參素作為丹參膠囊水溶性成分指紋圖譜的參照物。見表2～5。

圖3 陰性對(duì)照品HPLC圖譜

Fig.3 HPLC chromatogram of negative reference

由以上結(jié)果可知，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.061%～0.348%，相對(duì)峰面積RSD為12.365%～55.180%。由此可見，丹參膠囊水溶性分的種類一致性較好，但是有些成分在含量上有差別。

2.4.2 丹參膠囊水溶性成分HPLC指紋圖譜相似度分析 指紋圖譜相似度分析利用國家藥典委員會(huì)推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004年A版)對(duì)測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，得到丹參膠囊水溶性成分的共有指紋圖譜，對(duì)照共有指紋圖譜，各樣品相似度結(jié)果見表6，7。

由表6，7可以看出，除了雨林公司的3號(hào)丹參膠囊樣品相似度接近0.9外，其他樣品及共有模式的相似度均>0.99，相似度較好。因此，分別建立的兩個(gè)廠家的丹參膠囊水溶性成分HPLC對(duì)照指紋圖譜可行，可以作為評(píng)價(jià)丹參膠囊水溶性成分的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別采用了乙腈-磷酸溶液、甲醇-磷酸溶液及甲醇-乙腈-磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫[6-7]。結(jié)果表明，采用甲醇-乙腈-0.02%磷酸溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行分離能達(dá)到良好效果。

采用二極管陣列檢測器考察了270，280和286 nm波長下的樣品色譜分離情況。從色譜中觀察，在286 nm下色譜峰較多，因此選定286 nm作為檢測波長。

R：對(duì)照指紋圖譜

R：reference fingerprint chromatograms

R：對(duì)照指紋圖譜

R：reference fingerprint chromatograms

3.2 指紋圖譜建立及樣品分析 本實(shí)驗(yàn)分別建立兩個(gè)廠家丹參膠囊水溶性成分的HPLC對(duì)照指紋圖譜，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，指紋圖譜的相似度較高。在對(duì)樣品的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然樣品在種類上一致性較好，但是一些成分在某些樣品中未檢測到，例如原兒茶醛和丹酚酸A，并且批次間成分的相對(duì)含量也存在一定差異。這可能是由不同批次的原料藥存在差異所引起的。說明單憑測定一種成分的含量評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量存在較大局限性。另外，從圖譜中可知，兩個(gè)廠家的樣品存在一定差異，因此分別建立了各自的指紋圖譜。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.024

HPLC Fingerprint Analysis of Water-soluble Components inDanshenCapsules

ZHANG Jun1,CHENG Yuefa1,ZHANG Aibing2

(1.CollegeofJitang,HebeiUnitedUniversity,Tangshan063300，China; 2.TangshanInstituteforDrugControl,HebeiProvince,Tangshan063000，China)

Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint of water-soluble components indanshencapsules. Methods The HPLC was performed on a Thermo Syncronis C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm) with methanol-acetonitrile-phosphoric acid in water as mobile phase in gradient elution at a flow rate of 1 mL·min-1, and the column temperature was kept at 30 ℃.The detection wavelength was 286 nm. Results Nine and 22 common peaks were selected as the HPLC fingerprints of water-soluble components indanshencapsules from two manufactures, respectively.The standard HPLC fingerprints of water-soluble components were established. Conclusion The analysis is stable and reproducible, which can be applied to the quality control for water-soluble components indanshencapsules.

Danshencapsules; Water-soluble components; Chromatography, high performance liquid; Fingerprint

2013-11-20

2014-03-18

*2013年唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(13130298z)；2012年河北聯(lián)合大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(z201242)

張珺(1984-)，女，河北唐山人，講師，碩士，主要從事藥物分析工作。電話：0315-8114108，E-mail：zhangjun_2402@163.com。

程月發(fā)(1967-)，男，安徽桐城人，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物藥理學(xué)工作。電話：0315-8114108，E-mail：arthurcyf@163.com。

R282.71；R927

B

1004-0781(2015)01-0089-06