楊倩，鄧菊慶，馮曉潔，莊利萍，于璐，孫潔

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011）

·論著·

高遷移率蛋白B1對肝細(xì)胞癌血管生成的影響*

楊倩，鄧菊慶，馮曉潔，莊利萍，于璐，孫潔

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院病理科，云南 昆明 650011）

目的探討高遷移率蛋白B1（HMGB1）在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系。方法選擇30例肝細(xì)胞癌，運用免疫組織化學(xué)方法檢測HMGB1和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，并測定微血管密度，進行統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性分析。結(jié)果HMGB1和VEGF在肝細(xì)胞癌中呈強弱不等的表達(dá)，總陽性率分別為20/30（66.7%）和23/30（76.7%），高于癌旁組織及正常對照組織（P＜0.05），并且HMGB1與VEGF的表達(dá)具有相關(guān)性（r=0.408，P＜0.05）。HMGB1與肝細(xì)胞癌微血管密度正相關(guān)（r=0.529，P=0.008）；當(dāng)HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)＜25%時，微血管密度無明顯增加；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)＞25%時，癌組織微血管密度增加。結(jié)論在肝細(xì)胞癌中，HMGB1與VEGF表達(dá)上調(diào)有關(guān)，與肝細(xì)胞癌血管生成相關(guān)，HMGB1可能參與了腫瘤血管生成。

高遷移率蛋白B1；血管內(nèi)皮生長因子；肝細(xì)胞癌；腫瘤血管生成；微血管密度

高遷移族蛋白1（high mobility group protein box-1，HMGB1）在多種人類惡性腫瘤中存在高表達(dá)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前已知作用最強的血管生長因子之一。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法對肝細(xì)胞癌組織中HMGB1、VEGF表達(dá)進行檢測，并檢測肝癌組織微血管密度（microvessel density，MVD），研究HMGB1與VEGF表達(dá)及其與微血管生成的關(guān)系，從而探討HMGB1在肝細(xì)胞癌血管生成中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料

標(biāo)本來自2008年1月-2011年3月昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽外科的原發(fā)性肝癌患者30例。以距癌灶邊緣5 cm為分界分別留取肝癌癌灶組織和非癌組織。其中，男24例，女6例；年齡36～75歲，平均（59.6±10.5）歲；瘤體＜5cm 16例，瘤體≥5cm 14例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)證實為原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌，術(shù)前患者未行任何治療。另取5例正常肝組織為對照組。標(biāo)本常規(guī)脫水、4%甲醛固定、石蠟包埋，連續(xù)切片（片厚4μm）。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)采用SP法，兔抗人HMGB1多克隆抗體購自美國PTG公司，VEGF及CD34抗體購自美國Gene公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色，以PBS液代替一抗作為陰性對照，以已證實HMGB1、VEGF、CD34染色陽性的肝癌標(biāo)本作陽性對照。

1.2.2微血管計量采用免疫組織化學(xué)法（同上），以CD34為指標(biāo)，參考WEIDNER等[1]報道的微血管計量方法，即每一個染成棕黃色，可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織區(qū)分開的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，不論管腔和紅細(xì)胞出現(xiàn)與否，均作為一個單一的、可計數(shù)的血管。取實驗組織中HMGB1表達(dá)計為陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性（0，1，2，3分）的切片，于400倍視野內(nèi)計數(shù)微血管，各取5個高倍視野的均值，四舍五入后作為MVD值（微血管個數(shù)/0.42 mm2）。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲原則評定。1.2.3結(jié)果判斷①HMGB1定位于細(xì)胞質(zhì)和胞核，呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。每張切片在高倍鏡下（×200）隨機觀察5個視野，計數(shù)200個細(xì)胞/視野，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為表達(dá)陰性（-），陽性細(xì)胞數(shù)10%～25%為表達(dá)弱陽性（+），陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為表達(dá)中等強度陽性（++），陽性細(xì)胞數(shù)＞50%為表達(dá)強陽性（+++），分別計為0，1，2，3分。②VEGF定位于細(xì)胞漿和胞膜，呈棕黃色至棕褐色顆粒狀。以胞漿及胞膜著色強度打分：強陽性計為3分，陽性計為2分，弱陽性計為1分，陰性計為0分。1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行Spearman相關(guān)分析及非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HMGB1的表達(dá)

在30例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中，HMGB1總陽性率為66.7%（20/30），其中強陽性3例，陽性13例，弱陽性4例，陰性10例。癌旁組織中HMGB1總陽性率為40%（12/30），均為弱陽性。正常對照組織5例，無HMGB1表達(dá)。見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)顯示HMGB1在肝癌組織中呈陽性表達(dá)，定位于細(xì)胞核（×100）

2.2VEGF的表達(dá)

在30例肝細(xì)胞癌標(biāo)本中，VEGF總陽性率為76.7%（23/30），其中強陽性7例，中度陽性13例，弱陽性3例，陰性7例。癌旁組織中VEGF總陽性率為46.7%（14/30），均為弱陽性。正常對照組織5例，2例出現(xiàn)小灶狀VEGF弱表達(dá)。在血管和膽管中有時可見VEGF弱表達(dá)。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)顯示VEGF在肝癌組織中呈陽性表達(dá)，定位于胞漿（×100）

2.3HMGBI與VEGF表達(dá)的關(guān)系

在同一個病例中，HMGB1和VEGF的表達(dá)是不均一的，可以表現(xiàn)為部分肝細(xì)胞陽性而部分為陰性；然而，在這些病例里發(fā)現(xiàn)，HMGB1和VEGF在同一部位有著相似的表達(dá)，同為陰性或同為陽性。見圖3～6。

對于多個區(qū)域的HMGB1和VEGF的強度表達(dá)進行采樣及分析，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行

Spearman相關(guān)分析，HMGB1與VEGF表達(dá)存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.408，P=0.025。

圖3 HMGB1在肝癌組織中呈陽性表達(dá)（×40）

圖4 在肝細(xì)胞癌中，VEGF與HMGB1的陽性表達(dá)一致（×40）

圖5 HMGB1在部分膽管上皮內(nèi)可呈陽性表達(dá)（×100）

圖6 VEGF在同一膽管上皮內(nèi)呈陽性表達(dá)（×100）

2.4HMGBI與微血管密度的關(guān)系

在20例有HMGB1表達(dá)的病例中，選取癌組織表達(dá)HMGB1為陰性、弱陽性、中等陽性、強陽性（0，1，2，3分）的視野，進行微血管密度測定及分析。結(jié)果：HMGB1與微血管密度正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r= 0.529，P=0.008）；HMGB1陰性與HMGB1弱陽性組微血管密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（秩均值5.67、6.78，P=0.643＞0.05）；中度陽性與強陽性組微血管密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（秩均值6.94、5.17；P=0.459＞0.05）；弱陽性與中度陽性組微血管密度具有統(tǒng)計學(xué)差異（秩均值5.83、13.17；P=0.004＜0.05），弱陽性與強陽性組微血管密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（秩均值5.06、10.83；P=0.016＜0.05）。在肝細(xì)胞癌中，當(dāng)HMGB1陽性細(xì)胞數(shù)＜25%時，微血管密度無明顯增加；當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)＞25%時，癌組織微血管密度增加。見圖7。

圖7 肝細(xì)胞癌微血管密度增加（×200）

3 討論

HMGB1最初發(fā)現(xiàn)時是一種廣泛存在的DNA結(jié)合蛋白，一般情況下，HMGB1在多數(shù)細(xì)胞中呈基礎(chǔ)水平表達(dá)，它參與DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、修復(fù)以及細(xì)胞運動等。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)HMGB1可作為一種細(xì)胞因子，在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞受內(nèi)毒素、IL-1、TNF刺激后均能釋放。HMGB1還可由受損或壞死細(xì)胞釋放。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展研究方面，已發(fā)現(xiàn)HMGB1與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。

一些報道提示，HMGB1與腫瘤血管生成有關(guān)：HMGB1及其受體RAGE的結(jié)合會導(dǎo)致NF-κB的激活，進而使白細(xì)胞黏附分子和前炎癥反應(yīng)分子及血管生成因子表達(dá)上調(diào)[3]；HMGB1與肝磷脂形成的復(fù)合物也能促進血管生成[4]；在體內(nèi)外實驗中，人們利用抗體封閉HMGB1后，發(fā)現(xiàn)血管生成受到抑制[5]。MITOLA等[6]報道在體外實驗中，HMGB1可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的MAPK細(xì)胞外信號調(diào)解激酶（EPK）1/2信號活化，促進內(nèi)皮細(xì)胞增殖、修復(fù)機械性受損的內(nèi)皮細(xì)胞。HMGB1也可以通過直接活化內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞，動員其遷移至缺血區(qū)域，來促進血管新生[7]。

VEGF是目前比較明確的血管生長因子，癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移依賴新生血管的形成，VEGF在肝癌中高表達(dá)，對肝癌新生血管形成及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移起

重要作用。在鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、腎母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中，HMGB1與VEGF的關(guān)系已有文獻(xiàn)報道[8-9]。在肝細(xì)胞癌中，也發(fā)現(xiàn)HMGB1與微血管生成相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與VEGF-A的生成相關(guān)，阻斷HMGB1通路使得視網(wǎng)膜細(xì)胞株（RGC-5）中VEGFA減少[11]。SASAHIRA等運用重組人HMGB1蛋白作用于口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞后，能促進腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，亦從體外細(xì)胞水平為HMGB1參與到腫瘤血管生成過程中提供了實驗證據(jù)[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1與VEGF蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，提示在肝細(xì)胞癌血管生成過程中，異常表達(dá)增高的HMGB1與VEGF存在相關(guān)性?？赡艽嬖贖MGB1為促血管生成因子VEGF的上調(diào)提供了協(xié)同作用。另外，當(dāng)HMGB1表達(dá)達(dá)到一定程度（＞25%）時，癌組織微血管密度增加，提示HMGB1對腫瘤新生血管的作用可能在一定范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。HMGB1可作為評估肝細(xì)胞癌腫瘤血管生成的一個觀測指標(biāo)，可能成為阻斷肝癌血管生成的有效靶點。

[1]WEI DNER N.Chapter 14.Measuring intratumoral microvessel density[J].Methods Enzymol,2008,444:305-323.

[2]陳艷美,賀福初,林成招.HMGB1在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及其機制的研究進展[J].中國癌癥雜志,2012,22(10):784-789.

[3]VAN BEIJNUM JR,BUURMAN WA,GRIFFIOEN AW.Convergence and amplification of toll-like receptor(TLR)and receptor for advanced glycation end products(RAGE)signaling pathways via high mobility group B1(HMGB1)[J].Angiogenesis,2008,11(1): 91-99.

[4]WAKE H,MORI S,LIU K,et al.Histidine-rich glycoprotein inhibited high mobility group box 1 in complex with heparin-induced angiogenesis in matrigel plug assay[J].Eur J Pharmacol, 2009,623(1-3):89-95.

[5]VAN BEIJNUM JR,DINGS RP,VAN DER LINDEN E,et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected:specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature[J].Blood,2006,108(7): 2339-2348.

[6]MITOLA S,BELLERI M,URBINATI C,et al.Cutting edge:extracellular high mobility group box-1 protein is a proangiogenic cytokine[J].J.Immunol,2006,176(1):12-15.

[7]CHAVAKIS E,HAIN A,VINCI M,et al.High-mobility group box 1 activates integrin-dependent homing of endothelial progenitor cells[J].Circ Res,2007,100(2):204-212.

[8]李焱,蔣勇,史立群,等.HMGB1和VEGF-C/D在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2006,28(11): 1237-1239.

[9]張大,張國鋒,王家祥,等.兒童腎母細(xì)胞瘤HMGB1、RAGE及VEGF的表達(dá)及意義[J].中華小兒外科雜志,2011,32(7):534-538.

[10]周寶勇.HMGB1在肝癌中的表達(dá)及其與VEGF,MVD的關(guān)系[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,37(5):409-412.

[11]LEE JJ,HSIAO CC,YANG IH,et al.High-mobility group box 1 protein is implicated in advanced glycation end products-induced vascular endothelial growth factor A production in the rat retinal ganglion cell line RGC-5[J].Mol Vis,2012,18:838-850.

[12]SASAHIRA T,KIRITA T,BHAWAL UK,et al.The expression of receptor for advanced glycation end products is associated with angiogenesis in human oral squamous cell carcinoma[J]. Virchows Arch,2007,450(3):287-295.

（張蕾 編輯）

Effect of high moboility group box 1 protein on angiogenesis in hepatocellular carcinoma*

Qian YANG,Ju－qing DENG,Xiao－jie FENG,Li－ping ZHUANG,Lu YU,Jie SUN
(The Affiliated Galmette Hostpital,Kunming Medical University, Kunming,Yunnan 650011,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of high mobility group box 1 protein(HMGB1)in hepatocellular carcinoma and its relationship to tumor angiogenesis.【Methods】The immunohistochemical SP method was used to detect the expressions of HMGB1 and vascular endothelial growth factor(VEGF)in the hepatocellular carcinoma tissue and paracancerous tissue of 30 patients.Microvessel density(MVD)was also measured.【Results】With high or low intensity,HMGB1 was expressed in the cancenoma tissue of 20 cases（66.7%）and VEGF in the cancenoma tissue of 23 cases(76.7%)among the 30 hepatocellular carcinoma patients,the positive rates were significantly higher than those of the pericarcinous tissue(40%,46.7%)and non－cancerous tissue(P＜0.05).The expression of HMGB1 was related with VEGF(r=0.408,P＜0.05). HMGB1 also related to MVD(r=0.529,P=0.008),MVD increased when the positive rate of HMGB1 was greater than 25%.【Conclusions】HMGBl and VEGF are closely correlated in hepatocellular carcinoma. HMGB1 may be involved in angiogenesis of hepatocellular carcinoma.

high moboility group box 1 protein(HMGB1);vascular endothelial growth factor;hepatocellular carcinoma;angiogenesis;microvessel density

R735.7

A

1005-8982（2015）24-0005-04

2015-04-10

云南省教育廳科學(xué)研究基金（No：2011C088）