趙曦，黃藝，李娟

1. 深圳市環(huán)境科學研究院，廣東 深圳 518001；2. 北京大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100871

外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron產(chǎn)漆酶能力及其對外加DDT和重金屬的響應

趙曦1*，黃藝2，李娟1

1. 深圳市環(huán)境科學研究院，廣東 深圳 518001；2. 北京大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100871

為評價外生菌根真菌紅絨蓋牛肝菌（Xerocomus chrysenteron）在不同營養(yǎng)條件和污染條件下產(chǎn)漆酶的能力，采用改良的Kottke營養(yǎng)液培養(yǎng)法研究了不同碳氮比、DDT處理和重金屬處理對X. chrysenteron漆酶活性的影響，探討了不同處理對漆酶活性的影響機制。結果表明：（1）X. chrysenteron漆酶粗酶對底物ABTS的米氏常數(shù)Km值為0.038 mmol·L-1。在接種X. chrysenteron后，漆酶活性的峰值出現(xiàn)在菌絲生長的穩(wěn)定期，靜置培養(yǎng)63 d后漆酶活性可達118 U·L-1。在靜置和振蕩條件下，X. chrysenteron在改良的Kottke營養(yǎng)液中的最大產(chǎn)漆酶量均為157 U·L-1，振蕩培養(yǎng)不能提高最大漆酶產(chǎn)量。高的碳氮比條件下（葡萄糖與(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度之比為20）可以獲得較大的漆酶活性。（2）在培養(yǎng)的第54天，1 mg·L-1DDT和5 mg·L-1DDT處理的培養(yǎng)基中的漆酶活性相比對照分別提高了0.5倍和1倍，顯示出DDT對產(chǎn)漆酶的誘導作用。（3）低濃度（1 mmol·L-1）的不同重金屬對X. chrysenteron漆酶活性有不同的影響，在培養(yǎng)的第54天，Cu和Cd能夠?qū)⑵崦富钚苑謩e提高2.6倍和0.3倍，Mn對漆酶活性沒有明顯的影響，Zn降低了漆酶活性，Hg則完全抑制了漆酶活性。高濃度的Cu（5 mmol·L-1）對漆酶活性的提高不明顯，而高濃度的Cd（5 mmol·L-1）則降低了漆酶活性。重金屬對X. chrysenteron漆酶活性的影響機制可能包括通過對漆酶基因的誘導或抑制，以及對菌絲生物量的影響，進而對漆酶活性產(chǎn)生影響。研究表明，高的碳氮比、適當質(zhì)量濃度的DDT處理及低濃度的Cu、Cd處理均能促進X. chrysenteron產(chǎn)漆酶，顯示出其在POPs和重金屬復合污染環(huán)境下對POPs的降解潛力。

外生菌根真菌；Xerocomus chrysenteron；漆酶；DDT；重金屬

外生菌根真菌（英文名ectomycorrhizal fungi，簡稱ECMF）具有降解持久性有機污染物（英文名persistent organic pollutants，簡稱POPs）的能力。據(jù)統(tǒng)計，在已經(jīng)進行的外生菌根真菌降解POPs的研究中，45種菌種中有36種能降解至少一類POPs，有12種能降解多類POPs（趙曦等，2007）。DDT是一種有機氯農(nóng)藥，也是POPs的一種。本研究課題組分別于2007年和2013年首次報道了外生菌根真菌X.chrysenteron對DDT的降解作用（Huang等，2007）和礦化作用（Huang和Wang，2013）。

外生菌根真菌對DDT的這種降解和礦化作用可能與其產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶密切相關。大量研究表明外生菌根真菌能產(chǎn)生一系列與白腐真菌木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)相似的酶，這些酶具有降解POPs的巨大潛力（Meharg和Cairney，2000）。在木質(zhì)素降解酶系的三種酶中，漆酶的生成不需要嚴格的限碳和限氮條件且無需大量的 H2O2作為輔助劑，因此相比木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和錳過氧化物酶（MnP）具有更實際的應用前景。一些研究者直接采用從白腐真菌提取的漆酶對土壤中的 DDT進行處理，得了較高的DDT降解率（Zhao等，2010；Fan等，2013），顯示出真菌漆酶在POPs污染環(huán)境生物修復中的應用前景。

土壤環(huán)境的營養(yǎng)條件復雜，而且當前環(huán)境中的污染物也趨于多元化和復雜化，環(huán)境污染逐漸以由各種污染物構成的復合污染為主（鄭振華，2001）。復合污染土壤的生物修復逐漸成為研究熱點，有研究者報道了采用植物和微生物結合的方式，對DDT和 Cd復合污染土壤的生物修復研究（Zhu等，2012）。外生菌根真菌對重金屬有較好的耐受性（張英偉等，2014），其在POPs和重金屬復合污染環(huán)境下的產(chǎn)酶及對 POPs的降解效果研究具有現(xiàn)實意義。

本研究文通過實驗設計，探討 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的能力及不同碳氮比、DDT處理和重金屬處理對X. chrysenteron漆酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌種

實驗所用菌種為紅絨蓋牛肝菌（Xerocomus chrysenteron），采自北京西山無污染的針闊混交林，由北京林業(yè)大學森林病理研究室雷增普教授提供。

1.1.2 液體培養(yǎng)

將改良的Kottke營養(yǎng)液（Kottke等，1987）pH調(diào)至5.5，加入250 mL三角瓶，1.4×105Pa下126 ℃高溫滅菌20 min，冷卻。在無菌操作環(huán)境下，分別接種供試菌種于液體培養(yǎng)基上，封口，在 25 ℃下培養(yǎng)，備用。

1.2 實驗設計與處理

對照：制備改良Kottke液體培養(yǎng)基，每個250 mL三角瓶加入100 mL培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種3片9 mm直徑的X. chrysenteron固體培養(yǎng)瓊脂塊。封口，在25 ℃無光靜置培養(yǎng)。

振蕩培養(yǎng)：除采用100 r·min-1轉速振蕩培養(yǎng)，其他同對照。

不同C質(zhì)量濃度：以對照的10 g·L-1葡萄糖質(zhì)量濃度為基準，設置葡萄糖質(zhì)量濃度為5和20 g·L-1的處理。

不同 N質(zhì)量濃度：以對照的 0.5 g·L-1(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為基準，設置(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為0.25和1 g·L-1的處理。

DDT處理：在接種后的第18天，加入DDT使質(zhì)量濃度達到1.0和5.0 mg·L-1。

重金屬處理：在接種后的第 18天，分別加入CuSO4、CdCl2、MnSO4、ZnSO4、HgI2使?jié)舛冗_到1 mmol·L-1。另外加設Cu和Cd的高濃度處理，分別加入CuSO4、CdCl2使?jié)舛冗_到5 mmol·L-1。

每個處理設4個重復。所有處理在接種18 d后，每3 d取樣測定。

1.3 漆酶粗酶的提取方法

從培養(yǎng)有外生菌根真菌的三角瓶中取 500 μL培養(yǎng)液，用注射器配0.2 μm孔徑的濾頭過濾，制得漆酶粗酶液。置于1.5 mL V型離心管中，4 ℃以下冷藏待測。

1.4 測定方法

1.4.1 漆酶活性定量測定

以 ABTS (英 文 名 2, 2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) )為漆酶活性底物。3 mL的反應體系包括 0.5 mmol·L-1ABTS，100 mmol·L-1乙酸鈉緩沖液（pH 5.0），和0.1 mL粗酶液。25 ℃下，通過加入粗酶液來啟動反應。測A420下的吸光度的變化速率。1個單位（U）的酶活性定義為 25 ℃下每分鐘氧化 1 μmol ABTS（ε=36 L·mmol-1·cm-1）所需酶量。

1.4.2 酶動力學參數(shù)測定

以 ABTS為漆酶活性底物，測定不同濃度ABTS下的酶反應速率。

1.4.3 菌絲干質(zhì)量測定

對液體培養(yǎng)基用真空泵（SHB-III）直接抽濾。將菌絲體連同濾紙一起在105 ℃烘箱內(nèi)滅菌1 h，再置于烘箱內(nèi)80 ℃下烘干24 h，干燥器內(nèi)冷卻48 h，恒質(zhì)量后用分析天平（AR1140）測量干質(zhì)量。

1.4.4 剩余葡萄糖質(zhì)量濃度測定

采用蒽酮比色法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

均值和標準偏差計算采用 Microsoft Office Excel 2003軟件。t檢驗采用SPSS13.0軟件。產(chǎn)酶曲線擬合采用Origin 8.0軟件，Logistic方程擬合，N=K/(1+exp(a-rt))。

2 結果與分析

2.1 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的特性

2.1.1 X. chrysenteron漆酶產(chǎn)粗酶的酶動力學特征

測定在不同濃度底物（ABTS）的反應體系中X. chrysenteron漆酶粗酶反應的初速度，并采用最小二乘法回歸求解（圖1）。結果顯示，X. chrysenteron漆酶粗酶具有典型的酶動力學特征（v=20.24c/(0.038+c)，r2=0.996），其米氏常數(shù)Km值為0.038 mmol·L-1。

Km值反映的是酶對底物親和力的大小，Km值越小，酶對底物的親和力越大，其催化反應的效率就越高。目前鮮見關于外生菌根真菌的漆酶酶動力學研究報道，而白腐真菌漆酶的相關文獻較多，例如白腐真菌 Pycnoporus sanguineus、Pleurotus sajor-caju、Fomes fomentarius、Panus conchatus的漆酶降解ABTS的Km值依次為0.13、0.089、0.026和0.0057 mmol·L-1（Derek等，2007；Paolo等，2011；Mohamed和Atef，2010；張麗等，2013）。可見，X. chrysenteron漆酶粗酶對ABTS的親和力與幾種高產(chǎn)漆酶的白腐真菌相比，處于中等水平。

2.2.2 不同培養(yǎng)階段X. chrysenteron產(chǎn)漆酶活性

對在靜置的液體培養(yǎng)基中生長的 X.chrysenteron的菌絲干質(zhì)量及其產(chǎn)生的漆酶進行連續(xù)測定（圖2）。根據(jù)菌絲的生長曲線分析，在接種X. chrysenteron靜置的液體培養(yǎng)基中，接種后的0～6 d為菌絲生長的調(diào)整期，6～18 d為菌絲生長的對數(shù)期，18 d之后為菌絲生長的穩(wěn)定期。在 X. chrysenteron菌絲生長的調(diào)整期和對數(shù)期，培養(yǎng)基中只檢測到少量的漆酶。而在菌絲生長進入穩(wěn)定期后，漆酶活性逐漸呈現(xiàn)出對數(shù)增長趨勢，并在第63天達到了118 U·L-1。

圖1 X. chrysenteron漆酶粗酶氧化ABTS的米氏方程擬合曲線Fig. 1 Fitting curve of Michaelis-Menten equation for oxidation of ABTS by crude laccase from X. chrysenteron

圖2 X. chrysenteron在靜置的Kottke培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時間線Fig. 2 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in Kottke medium

與多種白腐真菌在接種的菌絲生長對數(shù)期即達到漆酶活性峰值相比（張麗等，2013；尚潔等，2013），X. chrysenteron漆酶活性在菌絲生長穩(wěn)定期才達到很高的濃度，63 d之后可達118 U·L-1，產(chǎn)酶量與多種漆酶高產(chǎn)白腐真菌的漆酶產(chǎn)量相當。大量研究表明，不同的白腐真菌的菌種，由于其漆酶基因的差異，表達階段差別較大，例如，白腐真菌Trametes sp.I62的漆酶基因有l(wèi)cc1和lcc2兩種，前者在菌絲生長的早期即可表達，而后者在菌絲生長的穩(wěn)定期才能表達（Mansur等，1998）。X. chrysenteron的在菌絲生長穩(wěn)定期表達的特征，應與其漆酶基因的類型密切相關。

2.2.3 正常培養(yǎng)下X. chrysenteron最大漆酶活性

振蕩培養(yǎng)條件下的漆酶活性增長速度比靜置條件下快，對靜置和振蕩條件下的產(chǎn)酶曲線進行非線性擬合（圖 3），兩個產(chǎn)酶曲線都較好地符合Logistic曲線L=K/(1+exp(a-rt))：

圖3 X. chrysenteron在Kottke培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時間線Fig. 3 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in Kottke medium

其中，K表示最大產(chǎn)酶量；a表示與初始產(chǎn)酶量有關的參數(shù)；r表示酶量瞬時增長率。

這個結果表明，培養(yǎng)體系中漆酶的積累模式符合 Logistic曲線，具有一個增長極限值，即最大產(chǎn)酶量。在靜置和振蕩條件下，X. chrysenteron在改良的Kottke營養(yǎng)液中的最大產(chǎn)漆酶量均為157 U·L-1。

2.3 不同碳、氮條件下X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量

碳源和氮源的質(zhì)量濃度和種類及其比值對漆酶活性影響較大，其中氮源起著關鍵作用（Eggert等，1996）。接種的第54天（表1），本研究中使用的正常 Kottle培養(yǎng)基的碳源葡萄糖質(zhì)量濃度為 10 g·L-1，氮源(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1。當葡萄糖質(zhì)量濃度降為5 g·L-1時，X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量比正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量減少了74%（P<0.001）；而當葡萄糖質(zhì)量濃度增至20 g·L-1時，漆酶產(chǎn)量與正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量之間沒有顯著性差異（P=0.461）。當(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度降為 0.25 g·L-1時，漆酶產(chǎn)量沒有明顯變化（P=0.668）；而當(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度增為 1 g·L-1時，漆酶產(chǎn)量比正常Kottle培養(yǎng)基中的漆酶產(chǎn)量減少了61%（P<0.001）。從C/N比來看，C/N比降低到10時，漆酶活性變??；而C/N比提高至40，漆酶活性并不能有效提高。限氮條件有利于提高漆酶活性。

表1 接種54 d后不同C/N比下X. chrysenteron的漆酶活性Table1 Laccase activity in X. chrysenteron medium of various carbon/nitrogen ratios after 54 d of culture

2.4 DDT對X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的影響

在本研究課題組報道的酶點試實驗中，DDT增強了外生菌根真菌X. chrysenteron的漆酶活性（黃藝等，2006）。為了確證這一結果，添加DDT到接種X. chrysenteron 18 d后的液體培養(yǎng)基中，使DDT質(zhì)量濃度達到1和5 mg·L-1。第45天后，添加DDT的培養(yǎng)液中漆酶活性顯著增強。在第54天，1和5 mg·L-1DDT處理的培養(yǎng)基中的漆酶活性分別比對照提高了0.5倍（P=0.010）和1倍（P=0.005）（圖4）。

圖4 X. chrysenteron在對照及添加1和5 mg·L-1DDT培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時間線Fig. 4 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in unsupplemented medium and medium containing 1 and 5 mg·L-1DDT

2.5 重金屬對X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的影響

為了探討重金屬對漆酶的影響，本研究選擇了Cd2+、Cu2+、Hg+、Mn2+、Zn2+等5種重金屬離子作為添加物和潛在的漆酶誘導劑。圖5顯示了在各種重金屬以 1 mmol·L-1濃度存在的情況下，X. chrysenteron產(chǎn)漆酶時間線。

圖5 X. chrysenteron在對照及添加1 mmol·L-1Cu、Cd、Mn、Zn和Hg培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶時間線Fig. 5 Time course of laccase activity during the growth of X. chrysenteron in unsupplemented medium and medium containing 1 mmol·L-1Cu, Cd, Mn, Zn and Hg

Cu是本研究中最有效的漆酶誘導劑，在加入到培養(yǎng)基后很快就誘導了 X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)生。Cu處理的培養(yǎng)基和對照（正常培養(yǎng)基中Cu的濃度為0.05 μmol·L-1）之間漆酶活性的差距隨著時間推移而擴大。在第54天，Cu處理的培養(yǎng)基中漆酶活性比對照提高了2.6倍（P<0.001）。作為一種生物非必需元素，Cd也提高了X. chrysenteron胞外漆酶的產(chǎn)量。在第54天，Cd處理的培養(yǎng)基中漆酶活性比對照提高了0.3倍（P=0.197）。與Cu和Cd的誘導效果相反，其他3種重金屬都抑制了漆酶的產(chǎn)量。Mn（P=0.045）和 Zn（P=0.002）降低了漆酶的活性，而在 Hg的處理下漆酶活性完全消失（P<0.001）。

重金屬對酶的作用與其濃度有很大關系。考慮到在1 mmol·L-1濃度的Mn，Zn和Hg的處理下，漆酶活性已經(jīng)受到抑制，因此只對Cu和Cd設計5 mmol·L-1的高濃度處理，并做進一步研究。兩種濃度的Cu處理都提高了漆酶活性。不過，高濃度的Cu（5 mmol·L-1）對漆酶活性的提高不明顯（P=0.430），而高濃度的Cd（5 mmol·L-1）則降低了漆酶活性（P=0.032）（表2）。

值得注意的是，在5 mmol·L-1Cu和Cd處理下，X. chrysenteron的生長受到了抑制，生物量分別下降了32%和24%。這表明，重金屬離子可以直接抑制或增強X. chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力，也可以通過抑制菌絲生物量來間接降低漆酶活性。在本研究中，菌絲生物干質(zhì)量和葡萄糖剩余量的結果顯示 5 mmol·L-1的Cu以及Cd、1 mmol·L-1的Zn和Hg都抑制了菌絲的生長（表2）。

處理 漆酶活性/(U·L-1) 單位菌絲干質(zhì)量漆酶活性/(U·g-1) 菌絲干質(zhì)量/g ρ(剩余葡萄糖)/(g·L-1)對照 81.5±8.0 63.67 0.128±0.008 0.33±0.06 1 mmol·L-1Cu 290.2±24.9 263.8 0.110±0.016 0.36±0.04 5 mmol·L-1Cu 109.4±65.6 125.1 0.087±0.009 0.47±0.13 1 mmol·L-1Cd 105.6±32.3 104.4 0.101±0.010 0.31±0.27 5 mmol·L-1Cd 63.3±10.6 64.6 0.098±0.003 0.24±0.02 1 mmol·L-1Mn 57.1±17.7 48.7 0.117±0.004 0.28±0.03 1m mmol·L-1Zn 29.6±18.8 29.9 0.099±0.009 0.30±0.00 1 mmol·L-1Hg 0.0±0.0 0.0 0.092±0.010 0.85±0.38

3 討論

X. chrysenteron是一種外生菌根擔子菌（Triguerosa等，2003）。County等（2006）發(fā)現(xiàn)在法國的一個自然林土壤環(huán)境下，X. chrysenteron在多個外生菌根真菌菌種中表現(xiàn)出了最強的漆酶活性。Luis等（2005）認為X. chrysenteron具有典型的漆酶基因，并用該菌種的漆酶基因來對德國巴伐利亞北部的針闊混交林中的土壤樣品提取出的漆酶轉錄序列進行歸類。本研究的結果驗證了 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的能力，并且該菌的漆酶基因可能主要在菌絲生長的穩(wěn)定期表達。在改良的Kottke營養(yǎng)液中，培養(yǎng) 63 d后產(chǎn)漆酶量可達 118 U·L-1，與多種漆酶高產(chǎn)白腐真菌產(chǎn)漆酶水平相當（Derek等，2007；Paolo等，2011；Mohamed和Atef，2010；張麗等，2013；尚潔等，2013）。正是由于X. chrysenteron的這種較強產(chǎn)漆酶能力，本研究課題組選擇該菌種作為外生菌根真菌降解 DDT和產(chǎn)漆酶研究的模式菌種。

一般認為，對產(chǎn)漆酶真菌采用振蕩培養(yǎng)方式可以獲得較高的漆酶活性，因為振蕩培養(yǎng)提高了營養(yǎng)物和氧氣在細胞間的傳質(zhì)效率（高大文等，2005）。本研究中靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)的最大產(chǎn)酶量一致，振蕩培養(yǎng)只是縮短了菌絲生長的對數(shù)期，使其提前進入了生長穩(wěn)定期并大量產(chǎn)酶，但并沒有最終提高其產(chǎn)漆酶的能力。這一點與其他學者的結論一致，Collins和 Dobson（1997）的研究表明，氧氣量的增加既不能促進真菌漆酶mRNA的轉錄，也不能提高真菌產(chǎn)漆酶的能力。

碳、氮的含量和種類及碳氮比對真菌漆酶產(chǎn)量起著關鍵作用。在白腐真菌中，漆酶的生成主要通過營養(yǎng)限制（主要是限N）來啟動。本研究中，無論C含量和N含量如何變化，C/N比（葡萄糖質(zhì)量濃度/(NH4)2HPO4質(zhì)量濃度）都是影響漆酶產(chǎn)量的最主要因素。Kottke正常培養(yǎng)基的C/N比為20，此條件下即可獲得較高的漆酶活性。相比無機氮，有機氮能夠因其能提高生物量而進一步提高漆酶活性（Arora和 Rampal，2002）。本研究中使用的氮源(NH4)2HPO4為無機氮，若更換為有機氮源，也許能進一步激發(fā)X. chrysenteron的產(chǎn)漆酶和降解DDT的能力。

本研究證實了 DDT能夠刺激外生菌根真菌的漆酶合成。Ritch和Gold（1992）、Soden和Dobson（2001）和 Xiao等（2006）分別在白腐真菌 P. chrysosporium、P. sajor-caju和Trametes sp. AH28-2的漆酶基因lac的啟動子中均發(fā)現(xiàn)了異生化合物結合序列（英文名xenobiotic responsive elements，簡稱XREs），該XREs編碼的結合蛋白能夠和許多異生芳環(huán)化合物結合（Fujisawa-Sehara等，1987）。鑒于外生菌根真菌漆酶基因和白腐真菌漆酶基因的同源性（Chen等，2003），可以推測，外生菌根真菌漆酶基因可能含有相似的XREs，而DDT作為一種異生芳環(huán)化合物，可能在基因水平上影響了外生菌根真菌的漆酶生成。

一些重金屬能在基因轉錄水平上提高真菌漆酶的產(chǎn)量，其中Cu是已經(jīng)被大量文獻廣泛確認的真菌產(chǎn)漆酶誘導劑（Alessandra等，2011；Galhaup和 Haltrich，2001）。在本研究中，Cu提高了 X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量，不過提高的幅度（2.6倍）與一些文獻報道的幅度（增加1～3個數(shù)量級）尚顯偏低（Alessandra等，2011），可能與本研究選擇的Cu濃度有關。這些文獻采用的 Cu濃度在 0.15～1 mmol·L-1之間，而本研究采用的是1 mmol·L-1。雖然 Cu是漆酶合成的必需元素，但是高濃度的 Cu能夠抑制菌絲的生長。在本研究培養(yǎng)的后期，5 mmol·L-1Cu 處理中菌絲的干質(zhì)量只有(0.087±0.009) g，甚至比1 mmol·L-1Hg處理中菌絲的干質(zhì)量(0.092±0.010) g還低。這表明在高濃度Cu處理下，X. chrysenteron的生長受到了嚴重的抑制。另外，高濃度的Cu也有可能抑制了漆酶基因的轉錄和表達。誘導 X. chrysenteron產(chǎn)漆酶的最佳 Cu濃度可能應低于1 mmol·L-1。

有研究表明，低濃度的Cd能促進白腐真菌的漆酶活性（Baldrian和Gabriel，2002）以及外生菌根真菌 Paxillus involutus漆酶基因的轉錄水平（Jacob等，2004）。在本研究中，低濃度的Cd提高了X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量，而高濃度的Cd降低了X. chrysenteron的漆酶產(chǎn)量，不過對菌絲的生長卻沒有太大的影響（5 mmol·L-1處理中菌絲干質(zhì)量(0.098±0.003) g；1 mmol·L-1處理中菌絲干質(zhì)量(0.101±0.010） g。這個結果表明，在5 mmol·L-1Cd處理下X. chrysenteron漆酶產(chǎn)量的下降主要原因可能是Cd對漆酶轉錄的抑制而不是菌絲生長的抑制。Jacob等（2004）的研究也表明，外生菌根真菌 P. involutus漆酶RNA的合成在0.05 ppm Cd處理下顯著提高，而在5 ppm Cd處理下受到抑制。因此，高濃度的Cu和Cd對X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量影響機理有所不同，高濃度的Cu主要通過抑制菌絲生長來影響漆酶產(chǎn)量，而高濃度的Cd則主要通過抑制漆酶mRNA的轉錄來影響漆酶產(chǎn)量。

Mn也被認為能夠誘導真菌產(chǎn)漆酶，Scheel等（2000）發(fā)現(xiàn)0.133 mmol·L-1的Mn提高了3種白腐真菌漆酶基因的轉錄水平，Soden和Dobson（2001）也發(fā)現(xiàn)Mn可以誘導真菌P. sajor caju、Clitocybula dusenii和Nematoloma frowardii產(chǎn)漆酶。不過本研究中1 mmol·L-1的Mn處理對X. chrysenteron漆酶的產(chǎn)量沒有明顯的影響，可能與Mn對漆酶的誘導作用具有菌種差異性有關，也可能與Mn濃度偏高有關。Manubens等（2007）的研究表明0.16～0.194 mmol·L-1的Mn可以抑制真菌C. subvermispora產(chǎn)漆酶。

Collins和 Dobson（1997）的研究表明0.0004～0.2 mmol·L-1的Zn對漆酶基因轉錄沒有影響（Collins和Dobson，1997）。本研究中，1 mmol·L-1的Zn在沒有誘導作用的前提下，由于抑制了菌的生長，而降低了菌的漆酶產(chǎn)量。

4 結論

（1）外生菌根真菌X. Chrysenteron具有很強的產(chǎn)漆酶能力，且 DDT對其產(chǎn)漆酶具有誘導作用。目前已經(jīng)有許多研究采用白腐真菌漆酶降解土壤DDT（Zhao等，2010；Fan等，2013），菌根真菌X. Chrysenteron及其漆酶在DDT污染土壤的修復中具有實際應用潛力。

（2）在低濃度的Cu2+和Cd2+等重金屬離子的處理下，X. Chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力有所提高，顯示出其在 POPs和重金屬復合污染環(huán)境下對 POPs的降解潛力。

（3）碳源和氮源的選擇及 C/N 比對 X. Chrysenteron 的產(chǎn)漆酶能力影響很大，X. Chrysenteron的產(chǎn)漆酶能力在合適的營養(yǎng)條件下，應還有較大的提升空間。

DDT和重金屬復合處理對X. Chrysenteron漆酶活性的影響，以及復合污染環(huán)境下 X. Chrysenteron對DDT的降解效果，尚需通過進一步研究探討。

ALESSANDRA P, PAOLA G, VINCENZO L, et al. 2011. Induction and transcriptional regulation of laccases in fungi[J]. Current Genomics, 12: 104-112.

ARORA D S, RAMPAL P. 2002. Laccase production by some Phlebia species[J]. J Basic Microbiol, 42: 295-301.

BALDRIAN P, GABRIEL J. 2002. Copper and cadmium increase laccase activity in Pleurotus ostreatus[J]. FEMS Microbiol Lett, 206: 69-74.

CHEN D M, BASTIAS B A, TAYLOR A F S, et al. 2003. Identification of laccase-like genes in ectomycorrhizal basidiomycetes and transcriptional regulation by nitrogen in Piloderma byssinum[J]. New Phytologist, 157: 547-554.

COLLINS P J, DOBSON A D W. 1997. Regulation of laccase gene transcription in Trametes versicolor[J]. Applied and Environmental Microbiology, 63(9): 3444-3450.

COURTY P, POUYSEGUR R, BUEE M, et al. 2006. Laccase and phosphatase activities of the dominant ectomycorrhizal types in a lowland oak forest[J]. Soil Biology and Biochemistry, 38: 1219-1222.

DEREK L, MARIELLE JV, ANDRE T. 2007. Purification and kinetics of a thermostable laccase from Pycnoporus sanguineus (SCC 108) [J]. Enzyme and Microbial Technology, 40(4): 563-568.

EGGERT C, TEMP U, ERIKSSON KEL. 1996. The ligninolytic system of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase. Appl Environ Microbiol, 62: 1151-1158.

FAN B, ZHAO Y C, MO G H, et al. 2013. Co-remediation of DDT-contaminated soil using white rot fungi and laccase extract from white rot fungi[J]. J Soils Sediments, 13: 1232-1245.

FUJISAWA-SEHARA A, SOGAWA K, YAMANE M, et al. 1987. Characterization of xenobiotic responsive elements upstream from the drugmetabolizing cytochrome P-450c gene: similarity to glucocorticoid regulatory elements[J]. Nucleic Acids Res, 15: 4179-4191.

GALHAUP C, HALTRICH D. 2001.Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus Trametes pubescens in the presence of copper[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 56: 225-232.

HUANG Y, WANG J. 2013. Degradation and mineralization of DDT by the ectomycorrhizal fungi Xerocomus chrysenteron[J]. Chemosphere, 92: 760-764.

HUANG Y, ZHAO X, LUAN SJ. 2007. Uptake and Biodegradation of DDT by 4 Ectomycorrhizal Fungi[J]. Science of the Total Environment, 385: 235-241.

JACOB C, COURBOT M, MARTIN F, et al. 2004. Transcriptomic responses to cadmium in the ectomycorrhizal fungus Paxillus involutus[J]. FEBS Lett, 576: 423-427.

KOTTKE I, GUTTENBERGER M, HAMMPP R, et al. 1987. An in vitromethod for establishing mycorrhizae on coniferous tree seedlings[J]. Trees, 1: 191-194.

LUIS P, KELLNERA H, MARTINB F, et al. 2005. A molecular method to evaluate basidiomycete laccase gene expression in forest soils[J]. Geoderma, 128: 18-27.

MANSUR M, SUA′REZ T, GONZA′LEZ AE. 1998. Differential gene expression in the laccase gene family from basidiomycete I-62 (CECT 20197)[J]. Appl Environ Microbiol, 64: 771-774.

MANUBENS A, CANESSA P, FOLCH C, et al. 2007. Manganese affects the production of laccase in the basidiomycete Ceriporiopsis subvermispora[J]. FEMS Microbiol Lett, 275: 139-145.

MEHARG A A, CAIRNEY J W G. 2000. Ectomycorrhizas-extending the capabilities of rhizosphere remediation?[J]. Soil Biol Biochem, 32: 1475-1484.

MOHAMED N, ATEF J. 2010. Purification, characterization and decolourization ability of Fomes fomentarius laccase produced in solid medium[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 64(1-2): 68-74.

PAOLO Z, ANTONIO R. 2011. Induction, purification and characterization of a laccase isozyme from Pleurotus sajorcaju and the potential in decolorization of textile dyes[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 68(2): 216-222.

RITCH T G J, GOLD M H. 1992. Characterization of a highly expressed lignin peroxidase-encoding gene from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium[J]. Gene, 118: 73-80.

SCHEEL T, H?FER M, LUDWIG S, et al. 2000. Differential expression of manganese peroxidase and laccase in white-rot fungi in the presence ofmanganese or aromatic compounds[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 54: 686-691.

SODEN DM, DOBSON AD. 2001. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajor-caju[J]. Microbiology, 147: 1755-1763.

TRIGUEROSA V, LOUGARREA A, ALI-AHMEDA D, et al. 2003. Xerocomus chrysenteron lectin: identification of a new pesticidal protein[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 1621: 292-298.

XIAO Y Z, HONG Y Z, LI J F, et al. 2006. Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses of their differential expression[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 71: 493-501.

ZHAO Y C, YI X Y, ZHANG M, et al. 2010. Fundamental study of degradation of dichlorodiphenyltrichloroethane in soil by laccase from white rot fungi[J]. Int J Environ Sci Tech, 7(2): 359-366.

ZHU Z Q, YANG X, WANG K, et al. 2012. Bioremediation of Cd-DDT co-contaminated soil using the Cd-hyperaccumulator Sedum alfredii and DDT-degrading microbes. Journal of Hazardous Materials, 235-236: 144-151.

高大文, 文湘華, 錢易. 2005. 白腐真菌培養(yǎng)條件對其分泌木質(zhì)素降解酶的影響[J]. 中國環(huán)境科學, 25(5): 572-575.

黃藝, 趙曦, 敖小蘭. 2006. 4種外生菌根真菌對滴滴涕的耐受性及生理響應[J]. 環(huán)境科學研究, 19(4): 36-41.

尚潔, 吳秋霞, 練小龍, 等. 2013. 碳源和氮源對木蹄層孔菌產(chǎn)漆酶的影響及酶學性質(zhì)研究[J]. 中國生物工程雜志, 33(11): 32-37.

張麗, 付時雨, 傅愷, 等. 2013. 白腐菌Panus conchatus產(chǎn)漆酶的誘導、純化及酶學特性研究[J]. 造紙科學與技術, 32(2): 24-36.

張英偉, 柴立偉, 王東偉, 等. 2014. Cu和Cd脅迫下接種外生菌根真菌對油松根際耐熱蛋白固持重金屬能力的影響[J]. 環(huán)境科學, 35(3): 1169-1175.

趙曦, 黃藝, 敖小蘭. 2007. 持久性有機污染物（POPs）的生物降解與外生菌根真菌對 POPs的降解作用[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 13(1): 140-144.

鄭振華, 周培疆, 吳振斌. 2001. 復合污染研究的新進展[J]. 應用生態(tài)學報, 12(3): 469-473.

Efficiency of Laccase Secretion by the Ectomycorrhizal Fungus Xerocomus chrysenteron and Its Responses to the Addition of DDT and Heavy Metals

ZHAO Xi1, HUANG Yi2, LI Juan1
1. Shenzhen Academy of Environmental Sciences, Shenzhen 518001, China; 2. College of Environmental Science and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China

The efficiency of laccase secretion by the ectomycorrhizal fungus Xerocomus chrysenteron and its responses to medium carbon: nitrogen ratio and the addition of DDT and heavy metals were studied in the modified Kottke medium. Additionally, the mechanisms underlying the observed responses were explored. Laccase secreted by X. chrysenteron showed high affinity for degrading 2,2'-azino-bis(3-ethylthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) with a half saturation constant (Km) of 0.038 mmol·L-1. Laccase activity was found to be highest at the stationary phase and reached 118 U·L-1after 63 d of culture. The maximum laccase activity could reach 157 U·L-1in both the static culture and the shaking culture. Elevating medium carbon: nitrogen ratio to 20 led to higher laccase activity. Adding 1 mg·L-1and 5 mg·L-1of DDT increased the laccase production by 0.5 and 1 fold after 63 d of culture, respectively. Adding 1 mmol·L-1of different heavy metals showed differential effects on laccase production. Cu and Cd increased the laccase production by 2.6 and 0.3 fold after 63 d of culture, respectively; Zn and Hg inhibited the laccase production; Mn showed no significant effects. Adding 5 mmol·L-1of Cu had no significant effects on the laccase production, while 5 mmol·L-1of Cd decreased the laccase production. These effects of heavy metals may be explained by laccase induction (or inhibition) and decreases in mycelium production caused by the metals. This study demonstrated that high carbon: nitrogen ratio and the addition of suitable concentrations of DDT, Cu and Cd could promote the laccase production by X. chrysenteron, suggesting the potential application of this fungus for degrading POPs in multiple-contaminant environment.

ectomycorrhizal fungi; Xerocomus chrysenteron; laccase; DDT; heavy metals

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.023

X171.5

A

1674-5906（2015）02-0329-07

趙曦，黃藝，李娟. 外生菌根真菌Xerocomus chrysenteron產(chǎn)漆酶能力及其對外加DDT和重金屬的響應[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2015, 24(2): 329-335.

ZHAO Xi, HUANG Yi, LI Juan. Efficiency of Laccase Secretion by the Ectomycorrhizal Fungus Xerocomus chrysenteron and Its Responses to the Addition of DDT and Heavy Metals [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(2): 329-335.

國家自然科學基金項目（41271325）

趙曦（1982年生），男，工程師，主要從事重金屬和持久性有機污染物的環(huán)境影響與污染防治研究。E-mail: zhaoxi5257@sina.com

2015-01-14