王 悅，孫金旭，朱會(huì)霞

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PHA高產(chǎn)菌株發(fā)酵條件優(yōu)化研究

王 悅，孫金旭，朱會(huì)霞

(衡水學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 衡水 053000)

以篩選出的生物環(huán)保材料PHA高產(chǎn)菌株SJ-9為初始菌株，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以丁酸鈉、碳氮比例、pH、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、誤差7種因素，利用L18(37)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行條件優(yōu)化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出適宜的發(fā)酵條件組合為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH為7.5，溫度為26℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，裝液量200mL/L．此條件下，PHA產(chǎn)量為3.31g/L．相對(duì)其未優(yōu)化條件產(chǎn)量提高46.5 %．

PHA；發(fā)酵；優(yōu)化；正交實(shí)驗(yàn)

傳統(tǒng)的高分子材料大多來(lái)源于石油化工，其大規(guī)模的生產(chǎn)加速了不可再生資源的利用，及其耐耗性也造成日趨嚴(yán)重的環(huán)境危害．聚烴基脂肪酸酯(PHA)作為一種新型的高分子材料，它的合成原料為糖、脂肪酸等可再生資源，并且具有生物可降解性和生物可相容性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)．這些特性可以有效地緩解資源緊張以及環(huán)境污染的現(xiàn)狀[1]．

因此近幾十年來(lái)，PHA的研究被各國(guó)所重視，其制品被應(yīng)用于塑料、醫(yī)學(xué)等各種領(lǐng)域[2-3]．其中，微生物大規(guī)模發(fā)酵法是獲取PHA的主要生物途徑，在國(guó)內(nèi)外均有大量研究，現(xiàn)階段限制PHA發(fā)展應(yīng)用的主要因素為優(yōu)勢(shì)菌種少、PHA產(chǎn)量過(guò)低、成本過(guò)高．因此，篩選PHA高產(chǎn)菌株以提高PHA產(chǎn)量勢(shì)在必行．本研究就實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的已篩選出的PHA高產(chǎn)菌株SJ-9[4]基礎(chǔ)上，對(duì)其培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高PHA產(chǎn)量．

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 PHA高效生產(chǎn)菌株SJ-9

衡水學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選保藏．

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

氣相色譜儀(Agilent GC7890)；紅外光譜儀(AVTAR36O)美國(guó)熱電尼高力公司；恒溫?fù)u床(ZHWY-2112B)上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司．

1.3 PHA提取與測(cè)定

氯仿提取與氣相色譜分析測(cè)定[4]．

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的條件，選取一定量的高產(chǎn)菌SJ-9采用正交實(shí)驗(yàn)法，選用對(duì)生產(chǎn)PHA的微生物合成能產(chǎn)生影響的碳源、碳氮比、初始pH值、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量為試驗(yàn)因素，各取3水平因素不同含量，以PHA產(chǎn)量(g/L)為參考指標(biāo)，進(jìn)行L18(37)正交實(shí)驗(yàn)安排，具體設(shè)計(jì)見(jiàn)表1．

表1 因素位級(jí)表

2 結(jié)果分析

對(duì)以PHA產(chǎn)量(g/L)為目的產(chǎn)物進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及方差分析，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2、表3．

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

注：* 表示具有顯著性.

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，極差的大小順序?yàn)锽﹥D﹥E﹥A﹥F﹥C，即影響PHA產(chǎn)率的7種因素的主次依次是碳氮比﹥溫度﹥轉(zhuǎn)速﹥丁酸鈉﹥裝液量﹥pH，其中碳氮比對(duì)PHA產(chǎn)率的影響最大，初始pH的濃度影響最?。容^3個(gè)因素不同水平下的綜合，發(fā)現(xiàn)A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2條件下PHA的產(chǎn)量最高，產(chǎn)量為3.31 g/L．

由方差分析結(jié)果可以得出碳氮比與溫度的比值大于臨界值19，分別為76.59與22.936，表明碳氮比與溫度對(duì)PHA的產(chǎn)率具有顯著性，并且各因素間的重復(fù)性差異極其顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信．方差分析顯示各因素對(duì)PHA的產(chǎn)率均有影響．

已有的研究得出，PHA顆粒數(shù)目在細(xì)胞積累初期就已固定，即PHA的積累與菌體量是同步進(jìn)行、同步完成的[3]．碳源與氮源是合成細(xì)胞的基礎(chǔ)物質(zhì)，本次實(shí)驗(yàn)表明，碳氮比對(duì)PHA的產(chǎn)率具有顯著性，也就進(jìn)一步驗(yàn)證底物對(duì)合成PHA的重要性．此次實(shí)驗(yàn)的最佳條件是碳氮比為最大40時(shí)，也驗(yàn)證了，合適的限氮條件可以增加PHA在細(xì)胞中的積累[5-6]．在菌種的培養(yǎng)條件中，溫度為最主要的一種，選擇合適的溫度不僅可以加速酶的活性，而且可以使菌種維持穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，溫度過(guò)高或多低，都會(huì)影響酶的活性，甚至?xí)⑺谰?xì)胞．

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，PHA高產(chǎn)菌株SJ-9的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH 為 7.5，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，裝液量200 mL/L．PHA產(chǎn)量為3.31 g/L．

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以PHA產(chǎn)量為指標(biāo)對(duì)SJ-9菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件利用L18(37)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行條件優(yōu)化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出，適宜的發(fā)酵條件組合為：丁酸鈉為2 g/L，碳氮比例為40，pH 為 7.5，溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min，裝液量200 mL/L．此條件下，PHA產(chǎn)量為3.31 g/L．相對(duì)未優(yōu)化條件下的產(chǎn)量提高46.5 %．其中，碳氮比對(duì)PHA產(chǎn)率的影響最大，同時(shí)溫度對(duì)PHA的產(chǎn)率的影響也具有顯著性．

[1] 陳國(guó)強(qiáng).生物高分子材料聚羥基脂肪酸脂(PHA)開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)化前景分析[J].化工新型材料,2010,38(10):1-7.

[2] 張瑞和.我國(guó)全降解塑料產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程[J].中國(guó)環(huán)保產(chǎn)業(yè),2005(1):39-41.

[3] ANDERSON A J, DAWES E A. Ocurrene, metabolism, metabolic roll and industrial uses of bacterial polyhy droxyalkanoates[J]. Microbilol,1990,54:450-472.

[4] 朱會(huì)霞.PHA生產(chǎn)菌株的篩選及生長(zhǎng)特性研究[J].China Brewing,2011,236(11):54-57.

[5] 陳志強(qiáng),田婷,溫沁雪,等.限氮和限磷對(duì)活性污泥合成聚羥基烷酸的影響[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào),2010(4):771-775.

[6] MADISON L L, HUISMAN G W. Metabolic engineering of poly (3- hydroxyalkanates): from DNA to plastic [J]. Microbiol Mol Biol Rev,1999,63:21- 53.

Optimization of Fermentation Conditions for High-producing Strain of PHA

WANG Yue, SUN Jin-xu, ZHU Hui-xia

(College of Life Science, Hengshui University, Hengshui, Hebei 053000, China)

With the selected high-producing strain SJ-9 of the biological environmental protection material PHA as the initial strain, the fermentation and culture conditions are optimized with L18(37) orthogonal experiment, in terms of sodium butyrate, PH, temperature, rotate speed, loaded liquid and error. The experiment shows that the appropriate fermentation condition is got when sodium butyrate is 2 g/L, the ratio of carbon and nitrogen is 40, pH is 7.5, temperature is 26 ℃, rotate speed is 150 r/min and the loaded liquid is 200 mL/L. Under this optimized condition, the PHA production is 3.31 g/L which is increased by 46.5 % when compared to former conditions.

PHA; fermentation; optimization; orthogonal experiment

(責(zé)任編校：李建明 英文校對(duì)：李玉玲)

10.3969/j.issn.1673-2065.2015.01.010

Q93-331

A

1673-2065(2015)01-0033-03

2014-09-22

河北省科技廳資助課題 (10215522)

王 悅(1985-)，女，河北衡水人，衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院助教，工學(xué)碩士；

孫金旭(1975-)，男，河北景縣人，衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院副教授，工學(xué)博士．