姜 偉，肖代雯，楊永長，劉 華，喻 華，黃文芳，李順君

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 檢驗科（成都 610072）

大腸埃希菌（Escherichia coli，ECO）是重要的醫(yī)院感染致病菌，可通過接觸、呼吸道氣溶膠吸入或侵入性操作等引起菌血癥或呼吸道、尿路及傷口感染等，給臨床治療造成極大困難［1－3］。目前國內(nèi)外研究通常采用管家基因（如16SrRNA）測序法鑒定病原微生物，但該方法耗時較長、操作繁瑣［4］。蛋白質(zhì)指紋技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種實驗檢測技術(shù)，具有操作簡便、快速、高通量、高靈敏性和高特異性的特點，主要用于分子或基因水平疾?。ㄈ缒[瘤）的早期檢測。本研究基于實驗室前期已建立的蛋白指紋技術(shù)與Fingerwave軟件結(jié)合的ECO快速診斷模型［5］，利用新近收集的臨床標(biāo)本進(jìn)行盲法驗證，以期為該技術(shù)的應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

收集四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院各科室2014年1－12月臨床標(biāo)本分離的菌株163株，經(jīng)VITEK－2全自動微生物分析儀鑒定，其中ECO 81株，鮑曼不動桿菌22株，肺炎克雷伯菌20株，銅綠假單胞菌15株，表皮葡萄球菌10株，金黃色葡萄球菌9株，陰溝腸桿菌6株。參考株為ECO株ATCC25922。

提取81株ECO細(xì)菌DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌體內(nèi)蛋白分子伴侶DnaJ編碼基因，擴(kuò)增長度約為719bp［5］。PCR產(chǎn)物純化后測序，所得產(chǎn)物序列與NCBI中基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

葡萄球菌和革蘭陰性桿菌分別接種于血平板和麥康凱瓊脂平板（安圖公司）［6］，于 35 ℃、6.5%CO2培養(yǎng)24h，然后挑取單個菌落再次接種于上述平板中，相同環(huán)境下培養(yǎng)24h。用接種環(huán)收集細(xì)菌至1.5mL離心管中，無菌雙蒸水洗滌3次，然后1 500r/min離心5min，離心半徑5cm，棄去上清，留取沉淀用于細(xì)菌蛋白提取。

1.3 細(xì)菌蛋白指紋圖譜檢測

參照我們前期研究方法［6］進(jìn)行細(xì)菌蛋白提取、PBSⅡ－C型蛋白質(zhì)芯片閱讀儀（Bio－Rad公司）參數(shù)設(shè)置及校正、蛋白指紋圖譜檢測。

1.4 獲取細(xì)菌蛋白指紋數(shù)據(jù)

采用Proteinchip軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，將標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)0.3～3.0的圖譜納入分析。統(tǒng)計前期篩選的19個標(biāo)志蛋白表達(dá)豐度，將其數(shù)據(jù)導(dǎo)入自建的Fingerwave軟件，設(shè)置鑒定閾值為0.7［5］。當(dāng)預(yù)測值≥0.7，歸為ECO；當(dāng)預(yù)測值＜0.7，歸為其他細(xì)菌。將模型鑒定結(jié)果與其他傳統(tǒng)方法及分子生物學(xué)方法進(jìn)行比較，計算靈敏度、特意度和符合率，評價模型診斷效能。

1.5 頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥的ECO蛋白指紋圖分析

頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦是臨床治療ECO感染的首選藥物［7］。篩選所收集菌株中對以上藥物均耐藥（9株）和均敏感（45株）的ECO蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)，對比分析兩組細(xì)菌蛋白表達(dá)的差異性。

2 結(jié)果

2.1 DnaJ基因測定結(jié)果

ECO的DnaJ基因擴(kuò)增產(chǎn)物均擴(kuò)增出目的條帶（圖1）。結(jié)果顯示與ECO符合率＞99%，確定為ECO（AB272648）。

圖1 ECO的DnaJ編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 蛋白標(biāo)志物在兩次檢測中的表達(dá)差異

ECO蛋白指紋圖譜（圖2）導(dǎo)入Biomarker Wizard軟件，對蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)29個所有細(xì)菌共同表達(dá)的蛋白質(zhì)峰。統(tǒng)計前期篩選的19個標(biāo)志蛋白質(zhì)峰的表達(dá)豐度，除15 724蛋白質(zhì)峰在本次檢測中表達(dá)略有增高外，其余蛋白質(zhì)峰的表達(dá)均降低，表達(dá)豐度為2.55～30.90（表1）。

表1 篩選的19個ECO標(biāo)志蛋白表達(dá)在兩次檢測中的表達(dá)差異

2.3 ECO蛋白指紋數(shù)據(jù)模型的建立及評價

81例ECO中有9例判錯，82例其他細(xì)菌中有13例判錯。ECO蛋白指紋診斷模型檢測ECO的敏感度為88.9%（72/81），特異度為84.1%（69/82），符合率為86.5%（141/163）。

2.4 耐藥/敏感ECO蛋白表達(dá)的差異性

兩組差異蛋白質(zhì)峰有7個；與敏感菌株比較，耐藥菌株中表達(dá)增高的蛋白質(zhì)峰4個，分別為9 068、11 994、17 442、18 820m/z；表達(dá)降低的蛋白質(zhì)峰3個，分別為7 485、8 597、15 901m/z。

圖2 兩次檢測獲得的部分ECO蛋白指紋圖譜比較

3 討論

ECO已成為醫(yī)院感染的主要病原菌之一，其檢出率僅次于銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌。目前，開發(fā)快速鑒定ECO感染的新技術(shù)或新方法，是臨床微生物學(xué)研究的重點之一［5］，從蛋白分子水平來檢測和鑒定病原微生物是其主要的研究方向。Bader［8］利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）技術(shù)鑒定了部分革蘭陽性和陰性細(xì)菌，結(jié)果表明，同種細(xì)菌間蛋白的表達(dá)相近，具有相似的蛋白指紋圖，因此根據(jù)細(xì)菌的蛋白指紋圖可快速鑒定細(xì)菌。我們前期的研究［5－6］也證明利用蛋白指紋圖譜技術(shù)及自建的Fingerwave軟件可快速鑒定多種細(xì)菌。本研究是對前期建立的ECO蛋白指紋數(shù)據(jù)模型的再次驗證，結(jié)果顯示該檢測模型對ECO的檢測靈敏度和特異度分別為88.9%和84.1%，與傳統(tǒng)微生物學(xué)方法及分子生物學(xué)方法相比，符合率為86.5%。

我們兩次檢測均采用相同方法提取和處理細(xì)菌蛋白，使用相同的檢測儀器和參數(shù)。但是，與前期研究檢測結(jié)果相比，本研究獲得的部分蛋白指紋圖中的蛋白質(zhì)峰數(shù)目有所減少，聚類分析后只得到29個共有蛋白質(zhì)峰，并且篩選的19個標(biāo)志蛋白中有18個存在表達(dá)降低，只有15 724蛋白質(zhì)峰表達(dá)略有增高，這可能與激光發(fā)射器的檢測效能下降有關(guān)。因此，在使用蛋白指紋圖譜儀的過程中，監(jiān)測和保證激光發(fā)射器的效能，建立標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程和質(zhì)量控制規(guī)則，對于保證實驗的重復(fù)性非常重要。本次研究ECO的鑒定符合率為86.5%，與前期研究結(jié)果（100.0%）相比，有所下降，提示建庫篩選的蛋白標(biāo)志物可能需進(jìn)一步優(yōu)化，但也可能是由于同種細(xì)菌間蛋白表達(dá)的差異性和多樣性導(dǎo)致。本研究對比分析了對頭孢西丁、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐藥或敏感的兩組ECO蛋白指紋圖，發(fā)現(xiàn)7個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)峰，表明蛋白指紋圖譜分析對于指導(dǎo)臨床合理使用抗生素也具有潛在應(yīng)用價值。

此外，兩次研究分析后也發(fā)現(xiàn)蛋白指紋圖譜檢測存在一些不足：1）研究平臺相對復(fù)雜且成本較高；2）篩選的差異蛋白還需要進(jìn)一步鑒定，以確定蛋白的本質(zhì)。

綜上所述，利用蛋白指紋圖譜技術(shù)鑒定ECO，具有簡單、快速、高通量的特性，在臨床微生物檢測中具有潛在應(yīng)用價值，但需進(jìn)一步優(yōu)化建庫的各細(xì)菌蛋白質(zhì)峰譜，建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程和質(zhì)控規(guī)則，并對確立的模型進(jìn)行大樣本量和多中心的驗證。

［1］Yamasaki S，Wang LY，Hirata T，et al.Multidrug efflux pumps contribute to Escherichia coli biofilm maintenance［J］.Int J Antimicrob Agents，2015，45（4）：439－441.

［2］Ahangarkani F，Rajabnia R，Shahandashti EF，et al.Frequency of class 1integron in Escherichia coli strains isolated from patients with urinary tract infections in north of iran［J］.Mater Sociomed，2015，27（1）：10－12.

［3］G?rge?S，Kuzucu?，Otlu B，et al.［Investigation of betalactamase genes and clonal relationship among the extendedspectrum beta－lactamase producing nosocomial Escherichia coli isolates］［J］.Mikrobiyoloji Bulteni，2015，49（1）：15－25.

［4］Khamis A，Raoult D，La Scola B.Comparison between rpoB and 16SrRNA gene sequencing for molecular identification of 168clinical isolates of Corynebacterium［J］.Journal of Clinical Microbiology，2005，43（4）：1934－1936.

［5］肖代雯，喻華，楊永長，等.表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜快速鑒定血液大腸埃希菌感染［J］.臨床檢驗雜志，2013，31（5）：349－352.

［6］肖代雯，楊永長，喻華，等.大腸埃希菌蛋白指紋圖譜的建立［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2008，20（5）：472－474.

［7］喻華，劉華，黃文芳，等.四川省細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2012年細(xì)菌耐藥性監(jiān)測［J］.中國抗生素雜志，2014，39（5）：332－337.

［8］Bader O.MALDI－TOF－MS－based species identification and typing approaches in medical mycology［J］.Proteomics，2013，13（5）：788－799.