林祥偉 張?zhí)K偉廣東省汕頭市中心醫(yī)院檢驗科，廣東汕頭515031

姬松茸粗多糖對K562細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制探討

林祥偉 張?zhí)K偉
廣東省汕頭市中心醫(yī)院檢驗科，廣東汕頭515031

目的 研究姬松茸粗多糖在K562細胞的增殖、凋亡，以及對轉錄因子NF-κB的影響，并探究其中的作用機制。 方法 培養(yǎng)K562細胞，再分別將（2、5、10mg/mL）姬松茸粗多糖加入其中作用48h，之后應用流式細胞術、免疫熒光法等方法觀察姬松茸粗多糖在K562細胞的增殖、凋亡和對NF-κB活性中的影響。 結果姬松茸粗多糖對K562細胞增殖有很顯著的抑制作用，還可以阻止細胞從G0/G1期到G2/M+S期過渡。經(jīng)過10mg/mL的姬松茸粗多糖誘導48h后，K562細胞CML細胞的凋亡率65.41%，較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而且NF-κB較對照組減少。 結論 姬松茸粗多糖能抑制K562細胞增殖，并且可以誘導其凋亡，其中的作用機制和NF-κB通道的異常激活明顯相關，值得進一步的研究。

姬松茸；K562細胞；增殖；凋亡；NF-κB

目前有報道在人肝癌、前列腺癌、結腸癌等實體瘤中，姬松茸均有抑制增殖作用和促其凋亡作用[1-5]。核因子NF-κB存在于體內多種細胞中，是一組作用較廣泛的真核細胞轉錄因子，它主要參與細胞內信號傳遞，并調控多種基因的表達。文獻資料顯示急性髓系白血?。ˋML）造血干細胞中絕大部分的細胞核因子NF-κB均有異?；罨磉_現(xiàn)象[6-9]。本實驗以慢性粒細胞白血病（CML）細胞株K562作為實驗對象，研究姬松茸粗多糖對K562細胞的增殖抑制作用以及其誘導凋亡的作用，并且闡述核因子NF-κB核因子在該過程中所起的作用。

1　材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

慢性粒細胞白血病細胞株K562先在含10%胎牛血清和100U/L青霉素以及100U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基里懸浮培養(yǎng)。

1.2實驗分組

培養(yǎng)K562細胞的過程中，往其加入ABM粗多糖，并使其終濃度為2、5、10mg/mL。接著再分別培養(yǎng)K562細胞48h，使用不含ABM粗多糖的培養(yǎng)基來培養(yǎng)K562細胞作為其對照組。

1.3細胞周期檢測

K562細胞周期的測定應用流式細胞術來分析。在姬松茸多糖作用48h后的K562細胞以1×10 5個以體積分數(shù)為0.7的乙醇固定以后，用PBS洗2次，加入RNA酶30μL，在37℃下水浴30min，最后冰浴終止反應；用PBS洗1次，加入PI染液0.5mL，避光孵育30min后，上機檢測，并分析細胞的周期變化。

1.4細胞凋亡檢測

采用流式細胞術檢測K562細胞凋亡率并收集姬松茸粗多糖作用過的K562細胞，使其在1500rpm的狀態(tài)下離心5min，并且將上清液去掉，選擇磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）慢慢地的進行重懸細胞，然后進行計數(shù)，從重懸細胞中提取5～10萬數(shù)目，同樣在1500rpm下離心5min，去掉上清液，加入195μL Annexin V-FITC結合液緩慢地重懸細胞，繼續(xù)加入5μL Annexin V-FITC并且慢慢地混合均勻，在常溫（21～25℃）下，暗處孵育10min。在1500rpm下離心5min，去掉上清液搖晃均勻，放置避光處冰浴。經(jīng)過流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC顯示為綠色熒光、PI顯示為紅色熒光。其中正常活細胞Annexin V-FITC（-）PI（-）；而凋亡早期細胞Annexin V-FITC（+）PI（-）；壞死細胞以及凋亡晚期的細胞Annexin V-FITC（+）PI（+）。

1.5用EMSA法檢測K562細胞的核因子NF-KB的活性

核蛋白的提取：各組濃度的姬松茸粗多糖在作用K562細胞48h以后，收獲細胞，使用核蛋白抽提試劑盒來提取細胞核蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白的定量，保存在-80℃下備用。提取核蛋白提取物2μL，和γ-P32標記的NF-k寡聚核苷酸探針進行結合，并用聚丙烯胺凝膠電泳來分離NF-kB的探針復合物，接著電泳2h，然后在-70℃自顯影72h。NF-kB活性檢測的結果應用Bio-Rad公司Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)對膜片進行掃描，同時使用GELpro3.0軟件對其滯后帶灰度進行分析。

1.6統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1姬松茸粗多糖對K562細胞周期的影響

結果顯示，處于G0/G1期的細胞明顯增多，處于S期的細胞減少，而G2/M期的細胞則無明顯變化。說明姬松茸粗多糖作用于K562細胞后，可以把細胞周期阻滯于G0/G1期，減少細胞進入S期，從而抑制細胞的增殖。

表1　姬松茸粗多糖作用于K562細胞48h后細胞周期變化

表1　姬松茸粗多糖作用于K562細胞48h后細胞周期變化

細胞周期G0/G1期　S期　G2/M期0（對照組）　70.43±0.41　29.77±0.50　1.63±0.67 2 82.73±0.75　20.70±0.82　1.80±0.36 5 85.17±1.19　16.00±1.15　1.53±1.81 10　89.67±0.70　12.67±0.93　1.81±2.18 F 73.210　21.311　12.53 P 0.008　0.041　0.046姬松茸粗多糖濃度（mg/mL）

2.2姬松茸粗多糖對K562細胞凋亡的影響

K562細胞經(jīng)2、5、10mg/L的姬松茸粗多糖作用48h后，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示，姬松茸粗多糖可以誘導K562細胞凋亡，且隨著濃度增加其作用效果更強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

表2　姬松茸粗多糖作用于K562細胞 48h后細胞凋亡率變化

表2　姬松茸粗多糖作用于K562細胞 48h后細胞凋亡率變化

姬松茸粗多糖濃度（mg/mL）　　細胞凋亡率0（對照組）　10.66±0.81 2 47.72±0.42 5 56.54±1.13 10　65.41±1.19 F 35.761 P 0.0078

2.3姬松茸粗多糖對K562細胞NF-κB 活性的影響

姬松茸粗多糖作用于K562細胞 48h后對照組細胞NF-κB灰度值為（712.12±24.15）；2、5、10mg/mL三組值分別為（419.31±15.11）、（319.91±27.76）、（120.17±11.31），結果顯示，K562細胞經(jīng)過2、5、10mg/L的姬松茸粗多糖作用48h后，能引起NF-kB的DNA結合的活性呈現(xiàn)劑量依賴性地降低，三組較對照組比較F=215.781，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3　討論

慢性粒細胞白血病是由于Ph染色體和p210 bcr-abl癌蛋白而導致的惡性造血干細胞疾病，是臨床上罕見的一種惡性腫瘤，約占所有癌癥的0.29%，接近占成人白血病的21%，在普通人群中的患病率達十萬分之一。其主要的特征是細胞過度增長、凋亡受抑以及粘附、遷移功能的異常。此病的發(fā)生不受年齡的限制，但以老年群體常見，平均發(fā)病年齡為64歲，臨床上男性患病的概率大于女性。目前，比較常用的治療方法就是接受化學療法，可一旦程度上緩解病情，但是毒副作用太大，受患者身體條件和耐受能力制約，骨髓移植可以治愈白血病，但是合適的配體較難找，移植后的抗排斥也是治療的難點[10]。

當前國內外研究慢性粒細胞白血病的關注點集中于化療藥物的研究，而中藥的抗白血病作用研究較少。尤其是姬松茸誘導腫瘤細胞的分化和促進凋亡，及其作用機制的研究更少。NF-κB是一類具有多向轉錄調節(jié)作用的細胞因子，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，它激活后參與多種基因的轉錄調控，且它在白血病等非實體瘤中能隨染色體擴增或者易位而發(fā)生遺傳學上的改變[11]。腫瘤細胞受腫瘤壞死因子刺激作用，引起細胞內激酶活化，導致NF-κB激活[12]；NF-κB活化后進入細胞核可以阻止激酶caspase-9的活化，阻斷細胞凋亡信號的釋放，從而起到抗細胞凋亡的作用。因此，通過抑制NF-κB活性，從而誘導腫瘤細胞的凋亡，可以為腫瘤的治療提供一個新的思路。

白血病是一種基因疾病，同時也是細胞周期的疾病。細胞周期是細胞存在的基本過程，每個細胞都在細胞周期中分化成熟衰老死亡，周而復始[13]。本實驗是通過姬松茸粗多糖作用于K562細胞后，觀察到處于G0/G1期的細胞顯著增多，而處于S期的細胞減少，G2/M期的細胞卻無明顯變化。這表明姬松茸粗多糖作用于K562細胞后，能把細胞周期阻滯于G0/G1期，并減少細胞進入S期，最終抑制細胞的增殖。

細胞凋亡對機體維持動態(tài)平衡起到很關鍵的作用。腫瘤細胞就是細胞的凋亡機制失效導致細胞失控無限增殖腫瘤細胞的凋亡紊亂打破了機體的動態(tài)平衡，逃離凋亡調控的細胞增殖而不凋亡。因此誘導腫瘤細胞凋亡在當前是臨床腫瘤治療學研究非常熱門的課題[14]。細胞凋亡是非常嚴格的基因調控過程，其主要的形態(tài)學改變是核固縮，核碎裂，核溶解，并且不引起周圍組織細胞炎癥反應[15]。本實驗則通過姬松茸粗多糖作用于K562細胞48h后，采用流式細胞儀來檢測細胞的凋亡率。而結果顯示，姬松茸粗多糖可以誘導K562細胞的凋亡，并且能隨著濃度的增加其作用的效果越明顯，且差異有顯著的統(tǒng)計學意義。

NF-κB作為一種核蛋白因子具有多向轉錄調節(jié)的特異性，它在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用，它的表達可以隨著非實體瘤細胞的染色體基因型的改變而發(fā)生變化[16]。有些異常的信號分子或癌蛋白能激活NF-κB，活化的NF-κB 被釋放進入細胞核，阻止caspase-9的活化從而起到抗凋亡的作用[17]；另外NF-κB也通過抑制JNK的活性，促進抗凋亡蛋白的表達，從而起到抑制凋亡的作用；因此通過抑制NF-κB的異常表達活化，有望成為抗白血病治療的新策略[18-19]。本實驗應用EMSA法檢測姬松茸粗多糖對K562細胞NF-κB的DNA結合活性，實驗結果顯示，姬松茸粗多糖作用于K562細胞48h后細胞核內的NF-κB的DNA結合活性顯著降低，提示姬松茸粗多糖誘導K562細胞凋亡作用可能與抑制NF-κB的活性有關系。

綜上所述，姬松茸粗多糖不僅可以抑制白血病細胞K562的增殖，同時通過抑制NF-kB的活性，來抑制了后者的抗細胞凋亡作用，從而促進了細胞凋亡。目前作為一種新的抗癌藥，姬松茸粗多糖已經(jīng)進入了臨床試驗，在過去幾年中積累的一系列臨床數(shù)據(jù)中姬松茸粗多糖有著非常廣譜的抗腫瘤活性，并對各種腫瘤細胞有抑制的作用，但是對正常細胞無明顯的作用[12]。這有望能成為新的抗白血病藥物，并為治療白血病提供新的思路。

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Explore of the effects of Agaricus blazei polysaccharide on proliferation and apoptosis of cells K562 and its mechanism

LIN Xiangwei ZHANG Suwei
Inspection Department, Shantou Central Hospital in Guangdong, Shantou 515031, China

Objective To study the influence of Agaricus blazei on proliferation and apoptosis of cells K562 and transcription NF- κB, and to explore the mechanism. Methods Cells K562 were cultured, then the 2, 5,10mg/mL of Agaricus blazei polysaccharides were respectively added to react for 48 hours, and then the effects of Agaricus blazei on proliferation and apoptosis of cells K562 and activity of NF- κB were observed with the methods such as flow cytometry, immunofluorescence. Results Agaricus blazei significantly inhibited the proliferation of cells K562, and also could prevent the cell transition from phase G0/G1 to phase G2/M+S. After induction by 10mg/mL of Agaricus blazei for 48 hours, apoptosis rate of cells K562 was 65.41%, which was significantly higher than that in control groups, and the differences were statistically significant (P＜0.01). However there were fewer factors of NF-κB than the control groups. Conclusion Agaricus blazei can inhibit the proliferation of cells K562, and can induce apoptosis of them, the mechanism of that is obviously related with abnormal activation of channel of factors NF- κB. However, it is worthy of further researches.

Agaricus blazei; Cells K562; Proliferation; Apoptosis; NF-κB

R285.5；R733.7

A

2095-0616（2015）11-25-04

廣東省中醫(yī)藥強省項目（20122037）。

（2015-03-23）