雷冬梅，郭瑞霞，劉泇希，葛 新，喬玉環(huán)

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與雌激素密切相關(guān)［1］。G 蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled estrogen receptor 30，GPR30)是一種新型雌激素受體，可以快速與微量雌激素結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)第二信使，通過更快的非基因組細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑對(duì)雌激素發(fā)生反應(yīng)［2］。作者所在的課題組前期研究［3］表明，GPR30 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A 和Ishikawa 中均有不同程度的表達(dá)。GPR30 可能通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4-5］;應(yīng)用PI3K 抑制劑可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。該研究觀察了下調(diào)GPR30 的表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤組織中PI3K/Akt 信號(hào)通路的作用，探討GPR30 用作治療子宮內(nèi)膜癌新靶點(diǎn)的可能。

1 材料與方法

1．1 材料 人子宮內(nèi)膜癌腺癌細(xì)胞系HEC-1A 和Ishikawa 由北京大學(xué)人民醫(yī)院魏麗惠教授惠贈(zèng)。BALB/c 裸鼠28只(5～6 周齡，雌性，SPF 級(jí))購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兔抗人GPR30 多克隆抗體購自英國Abcam 公司，Akt 和磷酸化Akt(p-Akt)抗體購自美國Santa Cruz 公司，DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，免疫組化染色SP 法檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體2000 購自Invitrogen 公司，干擾質(zhì)粒購自GriGene 公司。

1．2 Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中GPR30、Akt 和p-Akt 蛋白表達(dá)部位的檢測(cè) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)。Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2中靜置培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的Ishikawa和HEC-1A 細(xì)胞用胰蛋白酶進(jìn)行消化，以5 ×105/孔接種于6 孔板，鋪滿80%時(shí)終止培養(yǎng)，并于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛中固定10 min，封閉孵育30 min 后滴加一抗(GPR30、Akt 和p-Akt 抗體均按1∶1 000稀釋)孵育，4℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色后蘇木素復(fù)染。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)存在清晰的棕黃色顆粒者判定為陽性表達(dá)。

1．3 GPR30 表達(dá)下調(diào)后Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中GPR30 及p-Akt 蛋白表達(dá)水平的變化 將pGFP-V-RS(對(duì)照)或pGFP-V-RS-GPR30(干擾)分別用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，加入潮霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。取對(duì)數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，應(yīng)用蛋白印跡法檢測(cè)。離心收集細(xì)胞，加入適量苯甲基磺酰氟和細(xì)胞裂解液，冰上裂解，離心后取上清。制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜。一抗均按1∶1 000 稀釋;二抗按1∶5 000 稀釋。最后曝光并掃描各蛋白條帶，具體操作見文獻(xiàn)［4］。以p-Akt 與Akt 蛋白條帶灰度值的比值表示p-Akt 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平;以GPR30 與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示GPR30 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．4 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白表達(dá)的變化28只裸鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d，分4組，每組7只。收集對(duì)數(shù)生長期的干擾組和對(duì)照組的Ishikawa 和HEC-1A細(xì)胞，接種于BALB/c 裸鼠右背部皮下，1 周左右可觸及腫瘤小結(jié)節(jié)，當(dāng)移植瘤生長至直徑15～20 mm時(shí)，處死裸鼠，取部分腫瘤組織，用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定、切片。通過脫蠟、抗原修復(fù)后，加入血清封閉，分別添加p-Akt 一抗(按1∶1 000 稀釋)、二抗(按1∶5 000 稀釋)，PBS 沖洗，滴加SP，加顯色劑、復(fù)染、脫水、封片。以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有清晰的棕黃色顆粒者判定為陽性表達(dá)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)，經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，行兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)分析對(duì)照組和干擾組兩種細(xì)胞中GPR30 和p-Akt 蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中GPR30、Akt 和p-Akt 蛋白的表達(dá)部位 免疫細(xì)胞化學(xué)SP 法結(jié)果顯示，Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中GPR30、Akt、p-Akt蛋白均在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈棕黃色染色。見圖1。

2．2 GPR30 表達(dá)下調(diào)后Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中p-Akt 及GPR30 蛋白表達(dá)水平的變化 結(jié)果見圖2，表1、2。

2．3 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果(圖3)顯示，接種對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中p-Akt 的表達(dá)強(qiáng)于接種干擾組腫瘤細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織。

圖1 HEC-1A 和Ishikawa 細(xì)胞中2種蛋白的表達(dá)(SP，×200)

圖2 Ishikawa 和HEC-1A細(xì)胞中GPR30 及p-Akt 蛋白的表達(dá)水平

表1 Ishikawa 細(xì)胞中GPR30、p-Akt 蛋白的表達(dá)水平

表2 HEC-1A 細(xì)胞中GPR30、p-Akt 蛋白的表達(dá)水平

圖3 裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達(dá)(SP，×200)

3 討論

GPR30 基因位于7p22．3，并廣泛表達(dá)于心臟、腦、淋巴、卵巢、乳腺、子宮、肝臟、腎臟等［7］組織中。有關(guān)GPR30 的表達(dá)和定位一直存在爭(zhēng)議，以往多認(rèn)為GPR30 存在于細(xì)胞膜上。該研究結(jié)果顯示，GPR30 蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa 和HEC-1A中定位于胞質(zhì)，這一結(jié)果與Revankar 等［8-9］用免疫組化和熒光標(biāo)記等方法發(fā)現(xiàn)的GPR30 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果一致。

Akt 是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，Akt 活化需要蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的磷酸化［10］。Akt 異?；罨瘜?duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。雌激素與其受體結(jié)合后可通過“基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”發(fā)揮作用，也可以通過快速的“非基因轉(zhuǎn)錄效應(yīng)”發(fā)揮作用。近年來，部分學(xué)者［11］開始重視信號(hào)通路和子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。Revankar 等［8］發(fā)現(xiàn)在雌激素核受體表達(dá)缺失且GPR30 表達(dá)陽性的乳癌細(xì)胞中，雌激素可通過GPR30 激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而促進(jìn)乳癌細(xì)胞的增殖。前期研究［12］顯示，17β-E2處理后Ishikawa 和HEC-1A細(xì)胞中PI3K/Akt 的信號(hào)通路被激活。該研究通過轉(zhuǎn)染下調(diào)GPR30 蛋白的表達(dá)，觀察Ishikawa 和HEC-1A 細(xì)胞中GPR30 和p-Akt 蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，p-Akt 表達(dá)下降，說明兩種細(xì)胞PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化均受到抑制。此外，接種干擾組兩種腫瘤細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織中p-Akt 蛋白的表達(dá)均較接種對(duì)照組腫瘤細(xì)胞的裸鼠移植瘤組織減弱，與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示下調(diào)GPR30 蛋白的表達(dá)可能會(huì)抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化。

綜上所述，下調(diào)GPR30 的表達(dá)可能抑制了PI3K/Akt 信號(hào)通路的活化，為GPR30 成為治療子宮內(nèi)膜癌的新靶點(diǎn)提供了參考和依據(jù)。

［1］郭瑞霞，王建六，趙丹，等．子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa和HEC-1A 細(xì)胞雌激素受體表達(dá)［J］．中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2005，6(4):272

［2］張燕彩，郭瑞霞，葛新，等．GPER 在雌激素激活的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt 信號(hào)通路中的作用［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47(4):292

［3］郭瑞霞，郭會(huì)敏，苑中甫，等．G 蛋白偶聯(lián)受體30 和磷酸化AKT 在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)及意義［J］．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2009，18(12):881

［4］葛新．G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素的非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)的研究［D］．鄭州:鄭州大學(xué)，2013．

［5］張燕彩．GPER 在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞雌激素激活PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的作用［D］．鄭州:鄭州大學(xué)，2012．

［6］郭瑞霞，喬玉環(huán)，魏麗惠，等．磷脂酰肌醇3 激酶抑制劑對(duì)17β-雌二醇作用下Ishikawa、HEC-1A 細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，42(2):322

［7］Li Y，Birnbaumer L，Teng CT．Regulation of ERRalpha gene expression by estrogen receptor agonists and antagonists in SKBR3 breast cancer cells:differential molecular mechanisms mediated by g protein-coupled receptor GPR30/GPER-1［J］．Mol Endocrinol，2010，24(5):969

［8］Revankar CM，Cimino DF，Sklar LA，et al．A transmembrane intracellular estrogen receptor mediates rapid cell signaling［J］．Science，2005，307(5715):1625

［9］Revankar CM，Mitchell HD，F(xiàn)ield AS，et al．Synthetic estrogen derivatives demonstrate the functionality of intracellular GPR30［J］．ACS Chem Biol，2007，2(8):536

［10］Cantley LC．The phosphoinositide 3-kinase pathway［J］．Science，2002，296(5573):1655

［11］喬玉環(huán)，侯藝芳，郭瑞霞，等．人子宮內(nèi)膜癌組織中磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的檢測(cè)［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，43(2):273

［12］Guo RX，Wei LH，Tu Z，et al．17 beta-estradiol activates PI3K/Akt signaling pathway by estrogen receptor(ER)-dependent and ER-independent mechanisms in endometrial cancer cells［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2006，9(1):9