李海霞，楊 耀，路春波，羅 政，張振中

鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州450001

蘆丁又名蕓香苷，是中藥槐米的主要成分，亦廣泛存在于食物中;作為生物類黃酮(亦稱維生素P)，具有不可多得的防病治病作用，如降低毛細(xì)血管脆性與通透性、維持血管彈性、防止血細(xì)胞凝集、抗氧化、抗炎、抗過敏、抗癌等［1］。臨床用于高血壓、腦出血、再發(fā)性鼻出血、視網(wǎng)膜出血、急性出血性腎炎、出血性紫癜、創(chuàng)傷性肺出血、產(chǎn)后出血等的輔助治療，也常與維生素C 一起用作營養(yǎng)補充劑。但因其水溶性和脂溶性都很差，導(dǎo)致生物利用度較低，在體內(nèi)幾乎不被吸收，影響了其臨床療效和產(chǎn)品的應(yīng)用。納米脂質(zhì)體具有生物相容性好、可控釋放、靶向等優(yōu)點。將藥物制成納米脂質(zhì)體，是增加藥物溶解度、提高藥物生物利用度的一種有效方法。脂質(zhì)體制劑質(zhì)量評價中包封率是最重要指標(biāo)之一，只有藥物包封率達(dá)80%以上，才滿足藥典制劑學(xué)的要求［2-3］，而酸性化合物，采用醋酸鈣梯度主動載藥法制備，可大大提高包封率［4］;蘆丁為弱酸性黃酮類化合物，是否可采用此法制得高包封率的脂質(zhì)體，尚未見文獻報道。該研究主要以包封率為指標(biāo)，研究醋酸鈣梯度主動載藥法制備蘆丁納米脂質(zhì)體的最佳工藝，并進一步考察所得脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和體外釋放，為改善蘆丁溶解度，促進其在體內(nèi)吸收提供參考。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器 蘆丁(鄭州大學(xué)藥學(xué)院實驗室制備，純度99．9%);大豆卵磷脂(上海愛康精細(xì)化工有限公司，批號:120402);膽固醇(成都市科龍化工試劑廠，批號:070511);聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30);其他試劑均為分析純。KQ-3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵和98-2 型加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);截留相對分子質(zhì)量為8 000～10 000 物質(zhì)的透析袋(美國Sigma 公司);調(diào)溫電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(寧波新芝生物科技有限公司);AR1140 型電子天平(美國Ohous 公司);Nano-zs90 型激光納米粒度分析儀(英國Malvern 公司);Z323 型高速冷凍離心機(德國Hermle 公司)。

1．2 蘆丁納米脂質(zhì)體的制備 將大豆卵磷脂和膽固醇混合，溶于乙醚與氯仿(體積比為2∶1)的混合溶液中，再逐滴加入120 mmol/L 醋酸鈣溶液中，超聲得到穩(wěn)定的單一分散體。35℃減壓除盡有機溶劑，凝膠轉(zhuǎn)相為乳懸液時，以醋酸鈣溶液定容至10 mL，超聲處理，依次以0．45、0．22 μm 濾膜過濾3～4次，即得空白脂質(zhì)體。室溫下緩慢磁力攪拌，以適量30 g/L 蔗糖溶液透析空白脂質(zhì)體，建立醋酸鈣梯度。透析后的空白脂質(zhì)體，溫浴條件下加入一定量用溶解介質(zhì)溶解的蘆丁溶液，孵化即得蘆丁納米脂質(zhì)體。

1．2．1 醋酸鈣梯度建立條件考察 固定大豆卵磷脂濃度為50 g/L，卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比5∶1，透析時間1 h/次，制備空白脂質(zhì)體。取5 mL 空白脂質(zhì)體置透析袋內(nèi)，以30 g/L 蔗糖為透析介質(zhì)，室溫下緩慢磁力攪拌透析，考察空白脂質(zhì)體與蔗糖體積比(1∶10、1∶20)及透析次數(shù)(3次、4次)對醋酸鈣離子梯度建立的影響。用鈣指示劑指示終點，采用EDTA 絡(luò)合滴定法測定蔗糖溶液中鈣離子濃度。

1．2．2 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比 固定大豆卵磷脂濃度50 g/L，蘆丁∶卵磷脂質(zhì)量比(藥脂比)為1∶30，孵育溫度50℃，孵育時間15 min，考察卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比分別為2．0 ∶1．0、2．5 ∶1．0、4．0∶1．0、5．0∶1．0、8．0∶1．0、20．0∶1．0 時，蘆丁納米脂質(zhì)體的包封率。實驗重復(fù)3次。

1．2．3 藥脂比 固定大豆卵磷脂濃度50 g/L，卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比5∶1，孵育溫度50℃，孵育時間15 min，考察藥脂比分別為1∶80、1∶40、1∶30、1∶25 和1∶20時，蘆丁納米脂質(zhì)體的包封率。實驗重復(fù)3次。

1．2．4 孵育溫度 固定大豆卵磷脂濃度50 g/L，卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比5∶1，孵育時間15 min，藥脂比1∶30，考察孵育溫度為40、50、60 和70℃時，蘆丁納米脂質(zhì)體的包封率。實驗重復(fù)3次。

1．2．5 大豆卵磷脂濃度 固定膽固醇濃度4 g/L，藥脂比1∶30，孵育溫度50℃，孵育時間15 min，考察大豆卵磷脂濃度分別為20、30、40、50、60 g/L 時，蘆丁納米脂質(zhì)體的包封率。實驗重復(fù)3次。

1．2．6 蘆丁溶解介質(zhì)的考察 固定大豆卵磷脂濃度50 g/L，卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比5∶1，孵育時間15 min，藥脂比1∶30，孵育溫度50℃，考察蘆丁溶解介質(zhì)為20 g/L SDS、20 g/L PVP、20 g/L β-CD 時，蘆丁納米脂質(zhì)體的包封率。實驗重復(fù)3次。

1．3 蘆丁的HPLC 法測定

1．3．1 色譜條件［4］ODS C18 色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶冰醋酸(體積比32∶68)，柱溫為35℃，流速為1 mL/min，檢測波長257 nm，進樣量10 μL。

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取蘆丁對照品1．96 mg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇，超聲溶解，加甲醇至刻度，搖勻即得196 mg/L 的對照品溶液。依次精密量取該液0．25、0．50、1．00、1．50、2．00、2．50 mL，用甲醇稀釋至10 mL，制成4．9、9．8、19．6、29．4、39．2、49．0 mg/L 系列濃度溶液，各進樣10 μL，以峰面積A 為縱坐標(biāo)，濃度C 為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程A= 0．242C－0．028 (R2=0．999 5)，線性范圍為4．9～49．0 mg/L。

1．3．3 制劑測定 在所用色譜條件下，雜質(zhì)峰和藥物峰分離良好，輔料對藥物測定無干擾。蘆丁的保留時間約為20 min，理論塔板數(shù)不低于3 000。

1．4 蘆丁納米脂質(zhì)體的質(zhì)量評價

1．4．1 包封率測定 精密吸取200 μL 蘆丁納米脂質(zhì)體，用體積分?jǐn)?shù)為10%的Triton X-100 破乳，采用上述HPLC 測定，計算總藥量(W總)。另取蘆丁納米脂質(zhì)體200 μL 至超濾離心管中，12 000 r/min 離心30 min，取下層濾液稀釋后進樣、檢測，計算游離藥量(W游)。包封率=(W總－W游)/W總×100%。

1．4．2 粒徑與電位 超純水稀釋蘆丁納米脂質(zhì)體，混合均勻后，25℃條件下，用Nano-zs90 型激光納米粒度分析儀測定蘆丁納米脂質(zhì)體的粒徑分布和Zeta 電位。1．4．3 穩(wěn)定性 將脂質(zhì)體混懸液置于4℃冰箱保存，分別于設(shè)定時間點取樣，觀察脂質(zhì)體的絮沉現(xiàn)象并測定脂質(zhì)體的粒徑與電位。

1．5 體外釋放 精密稱取2 mL 蘆丁納米脂質(zhì)體溶液或含等量蘆丁的水溶液，置透析袋中，于30 mL含5 g/L SDS 的pH 7．4 PBS 溶液中透析，條件為:37℃，100 r/min 恒溫氣浴搖床振蕩。在設(shè)定時間點取樣2 mL，同時補加同溫等體積空白新鮮釋放介質(zhì)。以HPLC 測定2 mL 透析液中的蘆丁含量，按下式計算脂質(zhì)體的累積釋放率。

累積釋放率=(CtV0+∑CiVi)/W×100%。

Ct 和Ci 分別表示t次和第i次取樣的濃度，V0和Vi 分別表示釋放介質(zhì)體積和第i次的取樣體積，W 為脂質(zhì)體所含的總藥量。

2 結(jié)果

2．1 制備工藝

2．1．1 透析條件 測得初始醋酸鈣膜外為120 mmol/L，透析3次后降至0．12 mmol/L 以下，因此醋酸鈣在脂質(zhì)體雙分子層內(nèi)外相差已達(dá)到1 000 倍以上，而且空白脂質(zhì)體與30 g/L 蔗糖體積比為1∶10 與1∶20 時測得的鈣離子濃度接近，因此透析條件確定為10 倍空白脂質(zhì)體體積的30 g/L 蔗糖透析3次。

2．1．2 卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比 由表1 可知，隨著膽固醇比例的減少，脂質(zhì)體包封率亦逐步降低，但膽固醇比例過大(卵磷脂∶膽固醇的質(zhì)量比為2．0∶1．0、2．5∶1．0 和4．0∶1．0)時，脂質(zhì)體過于黏稠，這與目前公認(rèn)膽固醇具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用，被稱為脂質(zhì)體“流動性緩沖劑”的觀點一致。因此，綜合考慮包封率與流動性，選擇卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比為5．0∶1．0。

表1 卵磷脂和膽固醇質(zhì)量比對包封率的影響

2．1．3 藥脂比 如表2 所示，除了藥脂比1∶80 外，其他藥脂比對包封率影響不大，但在藥脂比為1∶25、1∶20 時，隨著放置時間增加，易于絮沉，穩(wěn)定性較差。綜合考慮成本和包封率，選擇藥脂比為1∶30。

表2 藥脂比對包封率的影響

2．1．4 孵育溫度 如表3 所示，孵育溫度增加至50℃時包封率不再增加，當(dāng)溫度超過50℃，包封率甚至呈現(xiàn)遞減趨勢，這可能因為卵磷脂在高溫下易于氧化變質(zhì)而使包封率降低，因此選擇孵育溫度為50℃。

表3 孵育溫度對包封率的影響

2．1．5 卵磷脂濃度考察 隨著卵磷脂用量的增加，包封率隨之增加，但卵磷脂超過40 g/L，包封率不僅降低，而且脂質(zhì)體流動性減弱(表4)。因此，選擇的卵磷脂為40 g/L。

表4 卵磷脂濃度對包封率的影響

2．1．6 蘆丁溶解介質(zhì)的考察 由表5 知，用PVP作為蘆丁溶解介質(zhì)時，所得到的脂質(zhì)體包封率最高，而且β-CD 水溶性差，低溫存放易分層，嚴(yán)重影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，因此蘆丁溶解介質(zhì)選擇PVP。

表5 不同溶解介質(zhì)對包封率的影響

2．2 蘆丁納米脂質(zhì)體的質(zhì)量評價

2．2．1 包封率 40 g/L 卵磷脂、卵磷脂∶膽固醇質(zhì)量比5．0∶1．0，藥脂比1∶30，20 g/L PVP 增溶的蘆丁作為外水相，50℃孵育15 min，包封率達(dá)到80．3%。

2．2．2 粒徑與電位 蘆丁納米脂質(zhì)體的平均粒徑在185 nm，電位－1．2 mV，多分散指數(shù)(PDI)為0．227。

2．2．3 穩(wěn)定性 按照最佳條件制備的蘆丁納米脂質(zhì)體樣品在28 d 時，仍為乳黃色混懸液，流動性良好，無分層現(xiàn)象;粒徑與Zeta 電位均未發(fā)生明顯變化，樣品穩(wěn)定性良好。

2．2．4 體外釋藥 不同時間藥物累積釋放率見圖1。蘆丁24 h 內(nèi)僅釋放了約23%的藥物，而蘆丁納米脂質(zhì)體24 h 內(nèi)釋放了約80%的藥物。

圖1 體外釋藥

3 討論

雖然蘆丁具有良好的防病治病作用，但口服吸收極少，限制了它在臨床的應(yīng)用，發(fā)展更好的制劑，已成為克服此類問題的主要研究方向［5-6］。口服用脂質(zhì)體，因其具有生物膜特性和藥物傳輸能力，具有較強的兩親性，可以提高親水性藥物的滲透性和水不溶性藥物的溶解度，最終提高藥物的口服跨膜吸收及體內(nèi)生物利用度［7］。

評價脂質(zhì)體制劑質(zhì)量，包封率是一項非常重要的指標(biāo)，因此《中國藥典》2010年版明確規(guī)定脂質(zhì)體制劑包封率不得小于80%［3］。包封率低也是脂質(zhì)體工業(yè)化的最大障礙之一［2］。醋酸鈣梯度主動載藥法可明顯提高酸性藥物的包封率，原因如下:空白脂質(zhì)體在逐步透析后，內(nèi)水相醋酸鈣中的醋酸根離子水合為醋酸，醋酸的跨膜速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鈣離子(為鈣的107倍)［8］，大量醋酸快速跨過脂質(zhì)雙分子膜進入外水相，留在內(nèi)水相中的OH－與弱酸性藥物所在的外水相形成了一定的pH 值梯度，成為制備弱酸性藥物的高效驅(qū)動力，使原本外水相中的藥物主動進入內(nèi)水相，從而大大提高包封率。該實驗考察結(jié)果顯示，醋酸鈣梯度主動載藥法在最佳條件下制備的蘆丁納米脂質(zhì)體包封率達(dá)到80．3%，符合藥典要求，可申報藥物新劑型。而采用傳統(tǒng)薄膜分散法制備的蘆丁納米脂質(zhì)體，包封率僅為66．5%［9］，不能成為藥物。

在pH 梯度載藥的過程中，外水相中分子態(tài)的弱酸性藥物越多，越易跨膜內(nèi)轉(zhuǎn)進入內(nèi)水相，而使包封率增加。但蘆丁在水中的溶解度僅為0．19 g/L［10］，為增加外水相中分子態(tài)蘆丁濃度，該實驗使用了溶解介質(zhì)增溶，結(jié)果表明PVP 可很好地提高包封率。

制劑的物理穩(wěn)定性與其粒徑、PDI、Zeta 電位等密切相關(guān)，實驗制備的蘆丁納米脂質(zhì)體已達(dá)納米級，而且PDI 較小，提示此脂質(zhì)體較穩(wěn)定。文獻［5］報道原料蘆丁在3．5 h 的體外累計溶出為16%，說明原料蘆丁在體外釋放度較低。經(jīng)制成納米脂質(zhì)體后，其釋放度大大增加，提示此脂質(zhì)體如在體內(nèi)使用，可能會增加體內(nèi)吸收，從而有效提高蘆丁的生物利用度。

綜上所述，作者制成符合藥典規(guī)定的蘆丁納米脂質(zhì)體，與蘆丁片相比，有望提高其生物利用度。

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