李學(xué)銀，張衛(wèi)星，張?zhí)鞓?biāo)，李 銳，王朝亮，王 瑞#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點學(xué)科開放實驗室;鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所鄭州450052

白消安又稱馬利蘭，為氮芥類烷化劑，臨床上常用于慢性粒細胞性白血病的化療。既往文獻［1-2］報道中有以腹腔注射40 mg/kg 白消安建立大小鼠唯支持細胞綜合征模型的先例，但是作者在前期實驗中發(fā)現(xiàn)此劑量引起實驗組34只SD 大鼠全部死亡，死亡時間為注射后7～12 d。雖然Ogawa 等［3］曾指出大鼠對白消安毒害作用更為敏感，白消安也更多地用于制備小鼠生精功能障礙模型和唯支持細胞綜合征模型，但大鼠用于此類動物模型制作具有許多不可替代的優(yōu)勢如:大鼠生命力強，能耐受多種有創(chuàng)操作;大鼠睪丸較大，方便行病理學(xué)檢查，且為后續(xù)研究中注射骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)提供方便;大鼠的精子發(fā)生過程與人類更接近［4］;既往文獻對大鼠BMSCs 的研究更成熟、深入，因此該實驗選擇SD 大鼠作為實驗對象。在結(jié)合相關(guān)文獻［5-6］的基礎(chǔ)上，作者觀察了分別經(jīng)腹腔分次注射及睪丸內(nèi)注射不同劑量白消安對SD 大鼠生精功能的影響，探討以其建立SD 大鼠生精功能障礙模型的可行性，為最終建立穩(wěn)定可靠的SD 大鼠唯支持細胞綜合征模型打下基礎(chǔ)，報道如下。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與主要試劑 140只6～8 周雄性SD大鼠［許可證號:SCXK(魯)2013-0001］，體重250～280 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，飼料及墊料由河南省實驗動物中心提供，于河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院動物中心飼養(yǎng)并進行實驗。白消安(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度＞98．5%)，二甲基亞砜(DMSO，鄭州萊寶生物科技有限公司，純度＞99．9%)，水合氯醛(普通市售，配制質(zhì)量濃度為100 g/L)。腹腔注射組白消安溶液的制備:每8 mg 白消安溶于1 mL DMSO 中，加入1 mL 雙蒸水，混勻;睪丸內(nèi)注射組白消安溶液的制備:以移液管分別取DMSO 和雙蒸水各0．025 mL 置于EP 管中，將白消安先溶于DMSO 再溶于雙蒸水，最終白消安質(zhì)量濃度為0．50～2．24 g/L?，F(xiàn)用現(xiàn)配，注射時將混合液置于37℃水浴箱中以防白消安析出。

1．2 經(jīng)腹腔分次注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用隨機數(shù)字表法分為7組，每組10只。A1、B1、C1、D1組(實驗組)分別注射劑量為40、30、20 和15 mg/kg 的白消安溶液，每只注射0．9～2．8 mL，E1組(溶劑對照組)注射DMSO 溶液2 mL，F(xiàn)1組(陰性對照組)注射雙蒸水2 mL，G1組(空白對照組)不處理。注射方法:以上劑量分為5次隔天注射入大鼠腹腔。

1．3 睪丸內(nèi)注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用隨機數(shù)字表法分為7組，每組10只，均注射左睪丸，A2、B2、C2、D2組注射劑量分別為0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg 的白消安溶液，E2組注射DMSO 溶液(溶劑對照組)，F(xiàn)2組注射雙蒸水(陰性對照組)，G2組(空白對照組)不處理。將大鼠仰臥位固定于大鼠固定板，以3 mL/kg 劑量水合氯醛腹腔注射麻醉后以吉爾碘消毒左側(cè)睪丸局部皮膚，以1 mL 注射器抽取溶液并注射至大鼠左側(cè)睪丸(由于睪丸體積較小，故統(tǒng)一注射0．05 mL)，進針約達睪丸橫徑1/3 時開始推液，邊注射邊進針，約至睪丸橫徑2/3 時推完溶液。

1．4 血常規(guī)檢測 將大鼠麻醉后以心臟采血法取血1～2 mL，采用日立7150 全自動血液分析儀自動檢測各組紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)。由于腹腔注射組不斷有大鼠死亡，所以在觀察到大鼠有明顯瀕死表現(xiàn)時即麻醉并取血和雙側(cè)睪丸;睪丸內(nèi)注射組觀察30 d 后取血和雙側(cè)睪丸。

1．5 睪丸病理檢查 所取大鼠睪丸標(biāo)本均以40 g/L 甲醛溶液固定、包埋、切片，并行HE 染色，使用德國Leica 顯微鏡觀察攝片。采用Salman 等［7］提出的改良Johnson 評分法評分。

1．6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)，各組間RBC、HGB 及睪丸病理評分的比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗，不符合方差齊性的數(shù)據(jù)(PLT)采用Wilcoxon 秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 生存狀況 腹腔注射實驗中各實驗組大鼠全部死亡，A1組死亡時間為完全注射白消安后0～2 d，B1組為4～6 d，C1組為12～21 d，D1組為9～16 d，死亡前均表現(xiàn)為虹膜變?yōu)榛野咨?、眼瞼結(jié)痂、活動遲緩等，另有部分表現(xiàn)有鼻周、肛周血跡，尾部皮膚破損等，各對照組均生長良好，無類似表現(xiàn)。睪丸內(nèi)注射組均生長良好。

2．2 血常規(guī)檢查 由于部分大鼠突然死亡或取血時發(fā)生血凝，腹腔注射實驗中4 實驗組只獲得15 份血常規(guī)結(jié)果，分別為A1組3 份，B1組3 份，C1組5份，D1組4 份。腹腔注射實驗各組大鼠血常規(guī)值見表1。睪丸內(nèi)注射實驗各組大鼠血常規(guī)結(jié)果見表2。2．3 睪丸病理 HE 染色結(jié)果見圖1，2 實驗各組大鼠睪丸組織Johnsen 評分結(jié)果見表3、4。

表1 腹腔注射實驗各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

表2 睪丸內(nèi)注射實驗各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

圖1 腹腔注射實驗和睪丸內(nèi)注射實驗中各組大鼠睪丸病理表現(xiàn)(HE，×400)

表3 腹腔注射實驗各組大鼠睪丸病理評分

表4 睪丸內(nèi)注射實驗各組大鼠睪丸病理評分

3 討論

近年來，重度少弱精癥及無精癥患者呈增加的趨勢?？蒲猩舷虿G丸移植BMSCs［8-9］已成為研究熱點，并且已有證據(jù)［10-11］證明鼠類BMSCs 能分化為睪丸生精細胞和間質(zhì)細胞或者說是生精細胞樣和間質(zhì)細胞樣細胞。白消安成分明確，對于大鼠的毒性主要為抑制骨髓造血干細胞。既往報道［2-3］用白消安制作大鼠生精功能障礙模型的劑量與致死率高低不一，40 mg/kg 劑量單次腹腔注射致死率在12．5%～100．0%。結(jié)合周雪原等［5］的經(jīng)驗，考慮到連續(xù)10次腹腔注射對大鼠損傷較大、操作復(fù)雜，該研究腹腔注射白消安中實驗組采用隔天、連續(xù)5次注射15～40 mg/kg 的白消安溶液，結(jié)果0～21 d 內(nèi)各實驗組大鼠仍全部死亡，血RBC、HGB 和PLT 較空白對照組降低;此外，可能由于死亡時間較早，各劑量組睪丸病理評分較空白對照組無明顯改變。

為探尋建立一種更為簡便、穩(wěn)定的生精功能障礙實驗動物模型的方法，作者亦嘗試了睪丸內(nèi)注射白消安溶液?？紤]到大鼠睪丸與體重比值約為1∶100，且睪丸內(nèi)注射使得藥物直接浸潤作用于睪丸，故劑量設(shè)定為0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg，結(jié)果顯示給藥組大鼠均生長良好，無一死亡，血RBC、HGB 和PLT 值較空白對照組無明顯變化，睪丸病理評分較空白對照組降低，但各組精原細胞及精母細胞均存在，說明4種劑量的白消安均可造成大鼠睪丸生精功能障礙，但尚不足以制作BMSCs 移植所需的唯支持細胞綜合征模型。結(jié)合王琛［6］的經(jīng)驗:6 mg/kg 劑量可以建立小鼠唯支持細胞綜合征模型，可以推測存在合適的較大的劑量制備大鼠唯支持細胞綜合征模型。由于睪丸內(nèi)注射吸收面積遠較腹腔注射小，并且即使加大劑量，白消安進入血液的量也遠較腹腔注射吸收少，因此并不會明顯增加對大鼠的毒害，可以在一個較大的劑量區(qū)域找出合適的劑量制備大鼠唯支持細胞綜合征模型。

綜上所述，經(jīng)腹腔注射白消安對大鼠毒害性很大，分5次隔天注射15～40 mg/kg 劑量白消安仍會導(dǎo)致大鼠30 d 內(nèi)死亡;0．1～0．4 mg/kg 劑量白消安睪丸內(nèi)注射均能引起大鼠生精功能障礙，是一種新的、值得深入研究的方法。

［1］Lue Y，Erkkila K，Liu PY，et al．Fate of bone marrow stem cells transplanted into the testis:potential implication for men with testicular failure［J］．Am J Pathol，2007，170(3):899

［2］張德迎．骨髓間充質(zhì)干細胞移植重建大鼠生殖功能的實驗研究［D］．重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2008．

［3］Ogawa T，Dobrinski I，Brinster RL．Recipient preparation is critical for spermatogonial transplantation in the rat［J］．Tissue Cell，1999，31(5):461

［4］Meistrich ML．Hormonal stimulation of the recovery of spermatogenesis following chemo-or radiotherapy［J］．APMIS，1998，106(1):37

［5］周雪原，任宇，馬玉珍，等．白消安致大鼠無精子癥模型的建立［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2012，12(32):6234

［6］王琛．一種新型白消安制備精原干細胞移植受體方法對小鼠生殖及生理功能的影響［D］．南寧:廣西大學(xué)，2013．

［7］Salman FT，Adkins ES，F(xiàn)onkalsrud EW．Morphologic effects of unilateral cryptorchidism on the contralateral descended testis［J］．J Pediatr Surg，1988，23(5):439

［8］Cakici C，Buyrukcu B，Duruksu G，et al．Recovery of fertility in azoospermia rats after injection of adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells:the sperm generation［J］．Biomed Res Int，2013，2013:529589

［9］Bhartiya D．Are mesenchymal cells indeed pluripotent stem cells or just stromal cells?OCT-4 and VSELs biology has led to better understanding［J］．Stem Cells Int，2013，2013:547501

［10］Nayernia K，Lee JH，Drusenheimer N，et al．Derivation of male germ cells from bone marrow stem cells［J］．Lab Invest，2006，86(7):654

［11］Yazawa T，Mizutani T，Yamada K．et al．Differentiation of adult stem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocortical cells［J］．Endocrinology，2006，147(9):4104