朱娟芳，田雪麗，楊文麗，田麗萍，陳 靜，高 勃

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院口腔醫(yī)學中心 鄭州450052 2)西北工業(yè)大學凝固技術(shù)國家重點實驗室 西安710072 3)第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院修復科西安710032

鈦及鈦合金具有優(yōu)良的物理機械性能、良好的化學穩(wěn)定性、耐腐蝕性、優(yōu)良的生物相容性以及價格低廉等優(yōu)點，在牙科的應用越來越廣泛。激光快速成型(laser rapid forming，LRF)技術(shù)是20 世紀90年代出現(xiàn)的一種先進的金屬零件制造技術(shù)，該項技術(shù)是將快速成型技術(shù)和激光涂覆技術(shù)有機結(jié)合起來的產(chǎn)物。該加工方法制作過程不需要模具，特別適合于需要根據(jù)不同病例特點的柔性制造，對于不同患者只需要改變CAD 模型即可，具有加工速度快、節(jié)約材料、制造試件不受復雜形狀限制等優(yōu)點。目前LRF 主要用于制造業(yè)領域［1-6］。該課題組利用LRF技術(shù)制造了純鈦(pure titanium，Ti)種植體的性能測試試樣，準微觀組織為細密網(wǎng)籃狀組織，具有更好的生物力學相容性［7］。人工種植體與天然人體器官有著本質(zhì)上的區(qū)別，要使植入體發(fā)揮良好的功能，關鍵在于植入體與相鄰組織形成良好的界面結(jié)構(gòu)［8］。界面的結(jié)構(gòu)性質(zhì)受多種因素的影響，尤其是受種植材料與骨組織的生物相容性和力學相容性的影響［9］。因此在LRF Ti 材料用于人體之前，需要通過活體動物研究材料植入后的周圍組織反應、植入體和骨組織界面的情況以及界面結(jié)合的牢固程度。該研究應用活體動物骨內(nèi)埋植實驗，從界面的組織學和生物力學角度，進一步探討LRF Ti 用作種植體時對骨的生物學作用及機制。

1 材料與方法

1．1 試樣及制備 將LRF Ti［7］(西北有色金屬研究院)加工成兩種規(guī)格的試樣(圖1A)。圓柱狀試樣(A 型):直徑2 mm，高6 mm;圓柱狀加帽試樣(B型):直徑2 mm，高6 mm，帽的部分直徑4 mm、高2 mm，在帽的部分沿直徑方向打一直徑1 mm 的孔，利于鋼絲穿過。每種規(guī)格試樣各12個。試樣采用丙酮超聲清洗10 min，無水乙醇洗5 min，去離子水洗5 min，高溫高壓消毒備用。工業(yè)純鈦［7］(CP Ti，西北有色金屬研究院)作為對照，加工出相同規(guī)格和數(shù)量的試樣。

1．2 實驗動物及設備 健康兔12只，體重2．5～5．0 kg，雌、雄各6只，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。按照第四軍醫(yī)大學實驗動物保健和使用指南，在標準化條件下進行喂養(yǎng)。實驗通過動物倫理委員會的批準，周期為4 周。萬能材料實驗機(日本島津)，掃描電鏡(JSM-640，日本電子公司)，X 射線機(美國熱電公司)。

1．3 試樣的植入 戊巴比妥鈉全身麻醉兔，預防性抗生素皮下注射。于兔股骨外側(cè)剪毛，手術(shù)區(qū)消毒?？v向切開兔股骨外側(cè)面，逐層切開并分離皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜。用鉆(2 000 r/min)在骨皮質(zhì)上鉆孔，穿透一側(cè)骨皮質(zhì)到達骨髓腔，同時用生理鹽水冷卻。每側(cè)肢體制備2個孔，孔間距大于8 mm，孔直徑為2 mm。在動物左右肢體的同一位置處，一側(cè)放置試樣，對側(cè)放置對照試樣。指壓將試樣插入孔內(nèi)，A 型種植體的上端與骨面平齊，B 型種植體的帽狀部分下端與骨面平齊，帽狀部分暴露在骨皮質(zhì)外面(圖1B)。逐層縫合肌筋膜、皮下組織及皮膚。

圖1 試樣(A)及其骨埋植(B)

1．4 觀測指標

1．4．1 一般觀察 術(shù)后觀察動物并記錄任何異常發(fā)現(xiàn):局部反應和異常行為。4 周后，用過量戊巴比妥鈉處死動物。立即取下含有植入體以及周圍組織的組織塊標本。

1．4．2 X 射線觀察 用X 射線機對所有組織塊標本拍攝X 射線片，觀察植入體周圍的骨組織情況。

1．4．3 病理組織學觀察 植入體以及周圍組織經(jīng)體積分數(shù)10%的甲醛固定后，將組織塊修整成小塊，每塊含有一顆種植體。再用體積分數(shù)10%的甲醛固定，用脫鈣劑(硝酸)脫鈣1 周，常規(guī)系列乙醇脫水，石蠟包埋。垂直植入體長軸進行連續(xù)切片，HE 染色，光學顯微鏡下組觀察并照相，進行組織學分級。

1．4．4 掃描電鏡觀察 將種植體組織塊樣本按常規(guī)方法制作成掃描電鏡標本，進行掃描電鏡觀察。

1．4．5 種植體生物結(jié)合力測試 對種有B 型種植體的動物，切取包含植入體及其周圍組織的組織塊，將組織塊表面磨平，與種植體垂直。放入實驗夾具內(nèi)。在種植體帽狀部分的孔內(nèi)穿入鋼絲，用萬能材料試驗機將種植體從骨內(nèi)拉出，速度1 mm/min，記錄載荷值。

2 結(jié)果

肉眼觀察LRF Ti 和CP Ti種植體周圍軟組織均無紅腫等炎癥反應，種植體均無松動。X 射線片(圖2)可見:LRF Ti 和CP Ti種植體周圍的骨組織連續(xù)，無骨吸收現(xiàn)象，骨組織與種植體接觸緊密。組織切片(圖3)可見:植入體擠壓就位植入4 周后的LRF Ti種植體骨界面愈合形式與CP Ti 植體完全相同，組織排列正常，無炎癥反應，無骨吸收。掃描電鏡(圖4)下可見種植體與骨組織界面之間有骨細胞突和骨膠原纖維，在骨松質(zhì)區(qū)，可見成纖維細胞和成骨細胞突、骨小梁伸向氧化膜的表面。B 型LRF Ti種植體界面的剪切力為(31．94±5．48)N，CP Ti 為(30．63 ±4．26)N，差異無統(tǒng)計學意義(t=0．469，P=0．651)。

圖2 術(shù)后4 周LRF Ti種植體(A)和CP Ti種植體(B)組織塊X 射線片

圖3 術(shù)后4 周骨界面病理組織學觀察(HE，×200)

圖4 術(shù)后4 周骨界面掃描電鏡圖(×5 000)

3 討論

金屬植入體植入人體內(nèi)后，要承受生物力的作用，種植體將生物力傳遞到周圍硬組織中，實現(xiàn)這一功能的生物學基礎是種植體與周圍骨組織之間形成良好的界面形態(tài)，而骨界面的力學性能是功能基礎。種植牙周膜結(jié)合界面是指種植體與周圍骨組織形成類似牙周膜的纖維附著，目前還未見到可靠的類似天然牙周膜的種植牙周膜。愈來愈多的研究［10-12］認為:骨結(jié)合界面最容易達到種植義齒的長期成功。

植入體植入人體后，作為一個外來物，對局部和全身均產(chǎn)生一定的影響。種植材料與骨組織的相互作用即種植體骨界面的愈合機制對種植材料的功能以及種植體的預后有著極其重要的意義，種植體表面的最初性狀決定了蛋白質(zhì)吸附的種類和數(shù)量，從而影響宿主細胞和材料表面的結(jié)合狀態(tài)［13］。Ti 由于極易在表面形成氧化膜TiO2，表現(xiàn)為一種惰性的界面狀態(tài)。該氧化膜起到了有機組織與無機種植體的轉(zhuǎn)換層作用。TiO2可部分形成一種TiOOH 基質(zhì)，該基質(zhì)可能能抑制超氧產(chǎn)物在炎癥中的產(chǎn)生，進而阻止氫氧根離子的釋放，使Ti 系種植體在植入?yún)^(qū)組織中保持穩(wěn)定的相容關系［9］。Petzold 等［14］認為Ti種植體表面的顯微結(jié)構(gòu)能夠影響表面的潤濕性，從而影響與宿主的界面接觸和早期血漿蛋白的生物反應。有良好潤濕性的表面結(jié)構(gòu)會促進種植體植入后與宿主組織的早期接觸，極大提高親和性。CP Ti由于優(yōu)良的生物相容性而廣泛應用于生物醫(yī)學領域，故該研究以CP Ti 作為對照。

該研究結(jié)果表明，種植體與骨組織界面之間可以見到骨細胞突和骨膠原纖維，在穿越骨松質(zhì)區(qū)，可見成纖維細胞和成骨細胞突、骨小梁伸向氧化膜的表面。說明植入體TiO2膜與機體組織的交界面不是處于靜止的接觸關系，而是通過活躍的化學反應形成機械性和化學性的復合結(jié)合狀態(tài)。

將種植體從周圍骨組織中拉出，所測量的是種植體與周圍組織之間的剪切力，可以間接反映在特定的時間點種植體與周圍組織之間的結(jié)合強度。該研究中，LRF Ti 和CP Ti 均采用光滑表面，因此表面性狀是一致的，將兩者的界面結(jié)構(gòu)和生物結(jié)合強度進行對比是有意義的。該實驗中，LRF Ti 和CP Ti種植體界面的剪切力差異無統(tǒng)計學意義，說明LRF Ti 與CP Ti種植體與骨組織有相同的結(jié)合強度。

綜上所述，LRF Ti 有良好的骨組織相容性，能夠在動物體內(nèi)形成良好的骨結(jié)合。

［1］Lu T，F(xiàn)inkenauer L，Wissman J，et al．Rapid prototyping for soft-matter electronics［J］．Adv Funct Mater，2014，24(22):3351

［2］Di Sante R．Laser extinction technique for measurements of carbon particles concentration during combustion［J］．Opt Lasers Eng，2013，51(6):783

［3］Mohammed MI，Abraham E，Desmulliez M．Rapid laser prototyping of valves for microfluidic autonomous systems［J］．J Micromech Microeng，2013，23(3):1

［4］Mckeown JT，Kulovits AK，Liu C，et al．In situ transmission electron microscopy of crystal growth-mode transitions during rapid solidification of a hypoeutectic Al-Cu alloy［J］．Acta Mater，2014，65:56

［5］Ahn DG．Applications of laser assisted metal rapid tooling process to manufacture of molding ＆ forming tools-state of the art［J］．Int J Precis Eng Man，2011，12(5):925

［6］Parthasarathy J，Starly B，Raman S．A design for the additive manufacture of functionally graded porous structures with tailored mechanical properties for biomedical applications［J］．J Manuf Process，2011，13 (2):160

［7］朱娟芳，高勃，王忠義，等．用于牙科植入體的激光快速成形純鈦性能研究［J］．中國激光，2007，34(4):588

［8］Tillitson EW，Craig RG，Peyton FA．Friction and wear of restorative dental materials［J］．J Dent Res，1971，50(1):149

［9］徐君伍．現(xiàn)代口腔修復學［M］．北京:高等教育出版社，2000:479

［10］Lee JH，Ryu MY，Baek HR，et al．The effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2-loaded tricalcium phosphate microsphere-hydrogel composite on the osseointegration of dental implants in minipigs［J］．Artif Organs，2014，38(2):149

［11］林曦，周磊．純鈦種植體表面特征的研究進展［J］．國際口腔醫(yī)學雜志，2014(6):677

［12］Nevins M，Camelo M，Koo S，et al．Human histologic assessment of a platform-switched osseointegrated dental implant［J］．Int J Periodontics Restorative Dent，2014，34(Suppl 3):s71

［13］Han CM，Kim HE，Koh YH．Creation of hierarchical micro/nano-porous TiO2surface layer onto Ti implants for improved biocompatibility［J］．Surf Coat Technol，2014，251:226

［14］Petzold C，Monjo M，Rubert M，et al．Effect of proline-rich synthetic peptide-coated Titanium implants on bone healing in a rabbit model［J］．Int J Oral Maxillofac Implants，2013，28(6):e547