路 堯，李 萍，趙國強，張國俊#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州450001

miRNA 是一類長度在19～25 nt 的非編碼小分子RNA，通過與靶基因序列3'-UTR 區(qū)域特異性結(jié)合調(diào)控基因表達，從而參與多種生理和病理過程，包括細胞增生、分化、凋亡及癌變等［1］。近年來miRNA 與臟器纖維化的基因表達調(diào)控成為研究熱點，為臨床靶向治療臟器纖維化提供了可能。特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是彌漫性間質(zhì)性肺病中的一種特殊類型，是一種原因不明、出現(xiàn)在成人、局限于肺、進行性致纖維化的間質(zhì)性肺炎［2］。miRNA-29b(簡稱miR-29b)在多種器官纖維化的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，包括心、肝、肺纖維化等［3］?，F(xiàn)有研究［4］證實miR-29b 在IPF 患者肺組織中表達顯著下調(diào)。因此，作者設(shè)計將miR-29b 的類似物(mimic)轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的人胚肺細胞IMR-90 細胞中，探討上調(diào)miR-29b 表達對上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 IMR-90 細胞株(ATCC 公司)，人重組TGF-β1 (rhTGF-β1，PeproTech 公 司)，miR-29b mimic(上海吉瑪生物有限公司)，高糖DMEM 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(HyClone 公司)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)，兔抗人β-actin、p-Smad3、Smad3、上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(Ecad)、間質(zhì)標(biāo)志物平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和下游靶基因Ⅰ型膠原蛋白(COL1A1)、GAPDH 多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(Bioss 公司)，總RNA 提取試劑盒(Omega 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo 公司)，實時熒光定量PCR 試劑盒(Thermo 公司)，BCA 蛋白定量試劑盒(Boster 公司)，PVDF 膜(Biosharp 公司)，ELC 發(fā)光劑(Beyotime 公司)。

1．2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染后形態(tài)學(xué)觀察 用含體積分?jǐn)?shù)10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2人工培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)IMR-90細胞，細胞呈貼壁生長后，用0．5 g/L 胰蛋白酶消化、傳代。當(dāng)細胞生長至70%～80%融合時，用無血清培養(yǎng)基靜止細胞24 h 使同步化，把細胞隨機分為4組:空白對照組、2 μg/L TGF-β1 誘導(dǎo)組、miR-29b 轉(zhuǎn)染組(2 μg/L TGF-β1 誘導(dǎo)48 h［5］+miR-29b mimic 瞬時轉(zhuǎn)染)及miR-29b 陰性對照組(2 μg/L TGF-β1 誘導(dǎo)48 h +無意義對照序列瞬時轉(zhuǎn)染，NC組)，于6 孔板中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至70%～80%融合時參照Invitrogen 公司的Lipofectamine 2000 試劑說明書進行轉(zhuǎn)染，然后正常培養(yǎng)于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2人工培養(yǎng)箱中48 h。使用倒置相差顯微鏡觀察各組細胞形態(tài)改變。

1．3 各組細胞中miR-29b 表達水平和上皮及間質(zhì)細胞標(biāo)志物mRNA 表達的實時熒光定量PCR 檢測各組細胞按對應(yīng)實驗要求處理后離心收集，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取細胞總RNA，檢測RNA 純度及濃度并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 于－20℃保存。采用實時熒光定量PCR 檢測miR-29b 表達水平(以U6 為內(nèi)參)及細胞中E-cad、α-SMA 和COL1A1 mRNA 表達水平(以GAPDH 為內(nèi)參)。引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。實時熒光定量PCR 反應(yīng)條件:95℃10 min 1個循環(huán);95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)。檢測結(jié)果用2-ΔΔCt相對定量分析方法進行計算。每組細胞培養(yǎng)時均設(shè)5個復(fù)孔。

1．4 各組細胞中上皮及間質(zhì)細胞標(biāo)志物蛋白表達的Western blot 檢測 各組細胞按對應(yīng)實驗要求處理后離心收集，提取細胞總蛋白，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，采用BCA 法，以一定濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，計算各組細胞提取的蛋白濃度。以50 μg 蛋白上樣量進行SDS-PAGE 電泳，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，50 g/L 脫脂奶封閉液室溫封閉1 h，分別加入Smad3、p-Smad3、E-cad、α-SMA 和COL1A1 的一抗(按1∶500 稀釋)，GAPDH為內(nèi)參(按1∶1 000 稀釋)，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL 發(fā)光劑，在美國ProteinSimple公司的PC-E 型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，掃描圖像。通過Image J 圖像分析軟件對蛋白條帶進行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值為相對表達量。每組細胞培養(yǎng)時均設(shè)5個復(fù)孔。

表1 引物序列

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17．0 進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t 檢驗比較各組細胞中miR-29b 表達水平、上皮及間質(zhì)細胞標(biāo)志物mRNA和蛋白表達的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 與空白對照組比較，TGFβ1 誘導(dǎo)組細胞由正常的鵝卵石形或多角形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?、紡錘形，細胞間連接變松散，呈現(xiàn)間充質(zhì)細胞形態(tài);與TGF-β1 誘導(dǎo)組相比miR-29b 轉(zhuǎn)染組細胞形態(tài)有明顯改變，呈現(xiàn)類似鵝卵石形或多角形上皮形態(tài);而NC組細胞形態(tài)仍呈間充質(zhì)細胞形態(tài)，與TGF-β1 誘導(dǎo)組相比無明顯變化，見圖1。

圖1 各組細胞形態(tài)學(xué)變化(×20)

2．2 各組細胞中miR-29b 及上皮和間質(zhì)細胞標(biāo)志物mRNA 的表達 見表2。

表2 各組細胞中miR-29b 和E-cad、α-SMA 和COL1A1 mRNA 相對表達量比較

2．3 各組細胞中上皮及間質(zhì)細胞標(biāo)志物蛋白表達的變化 見表3、圖2。

表3 各組細胞中Smad3、p-Smad3、E-cad、α-SMA 和COL1A1 蛋白相對表達量比較

圖2 各組細胞中上皮及間質(zhì)細胞標(biāo)志物蛋白的表達

3 討論

IPF 的病理表現(xiàn)為肺泡上皮細胞的損傷，肺泡EMT 發(fā)生，纖維母細胞以及成纖維母細胞灶形成，使細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)產(chǎn)生增多，導(dǎo)致ECM 過度沉積和肺泡結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致肺纖維化及肺功能受損［6］。EMT 主要表現(xiàn)為上皮細胞失去極性，與周圍細胞和基質(zhì)的接觸減少，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增加，同時細胞表型發(fā)生改變［7］。EMT受多種細胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)［8］。其中，TGFβ/Smad 是最主要的致纖維化信號通路，TGF-β1 可將胞漿中的Smad3 磷酸化后移位于細胞核中調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而介導(dǎo)EMT 的發(fā)生［9］。該過程中，上皮細胞的標(biāo)志物E-cad、橋粒斑蛋白等表達下調(diào);而間質(zhì)表型標(biāo)志物(如α-SMA、N-鈣黏蛋白、波形蛋白等［10］)表達上調(diào)，故作者選取E-cad、α-SMA 和COL1A1 來評定外源性TGF-β1 誘導(dǎo)EMT的發(fā)生機制。

miR-29b 是一個與纖維化疾病緊密相關(guān)的miRNA，參與多條信號通路的調(diào)控。Cushing 等［11］發(fā)現(xiàn)TGF-β1 可下調(diào)miR-29 表達，減輕其對TGF-β/Smad信號通路的抑制作用，導(dǎo)致ECM 的主要成分膠原蛋白(COL1A1、COL3A1 等)表達增多，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。這提示通過上調(diào)miR-29 的表達有可能會抑制TGF-β/Smad 信號通路介導(dǎo)的EMT 發(fā)生，進而延緩EMT 的發(fā)展。

該研究中，通過倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的IMR-90 細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，呈現(xiàn)間充質(zhì)細胞形態(tài)，細胞內(nèi)p-Smad3 蛋白表達量顯著增加，Ecad 表達顯著下降，α-SMA 和COL1A1 表達顯著上升，說明經(jīng)外源性TGF-β1 誘導(dǎo)后IMR-90 細胞已發(fā)生EMT。在此基礎(chǔ)上，將miR-29b mimic 轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)，上調(diào)miR-29b 在細胞內(nèi)的表達，檢測結(jié)果表明，與TGF-β1 誘導(dǎo)組相比，轉(zhuǎn)染miR-29b mimic 后細胞內(nèi)E-cad 的表達升高，而p-Smad3 蛋白表達量減少，且α-SMA 和COL1A1 的表達下降;通過倒置相差顯微鏡觀察，miR-29b 轉(zhuǎn)染組細胞形態(tài)由間充質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃迄Z卵石形或多角形正常上皮形態(tài)，細胞間連接恢復(fù)。結(jié)果提示，上調(diào)miR-29b 表達可對發(fā)生EMT 的IMR-90 細胞中TGF-β/Smad 信號通路產(chǎn)生一定程度的抑制作用，顯示miR-29b 具有抗纖維化潛能。

目前對miR-29b 抑制TGF-β/Smad 信號通路的具體作用機制尚不清楚，該研究中上調(diào)miR-29b 的表達后，發(fā)現(xiàn)COL1A1 的表達量降低，驗證了miR-29b 對ECM 中膠原蛋白表達的抑制作用;同時發(fā)現(xiàn)p-Smad3 表達量減少，而Smad3 蛋白作為TGF-β/Smad 信號通路的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其大量被磷酸化可將TGF-β1 與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的EMT 發(fā)生信號從胞質(zhì)傳導(dǎo)至胞核中，促進EMT 的發(fā)生。因此，推測上調(diào)miR-29b 表達可能抑制TGF-β1，減少EMT 發(fā)生信號的傳導(dǎo)，進而減緩EMT 的進程。不過，介導(dǎo)EMT 發(fā)生的信號通路還包括Wnt/β-catenin、NF-κB 和PI3K-AKT 等，其中多條信號通路可聯(lián)合相互作用，針對miR-29b 參與這些信號通路的具體作用有待進一步研究。

目前研究［12］證實miRNA 能夠游離于細胞之外，穩(wěn)定存在于血漿或血清中，在多種腫瘤和非腫瘤疾病的診斷和預(yù)后中顯示了獨特的價值，提示miR-29b 很有可能成為一種新型的反映纖維化程度的指標(biāo)，為及時發(fā)現(xiàn)和早期診斷IPF 提供線索;同時具有抗纖維化潛力的miR-29b 有可能成為新的分子治療靶點，為治療IPF 提供新的思路和方向。

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