王筱翔，林慶勝，尹 飛，胡珍娣，陳煥瑜，沈斌斌，陳小帆，馮 夏*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣州 510642;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640;3.廣東出入境檢驗檢疫局，廣州 510623)

小菜蛾Plutella xylostella(L.)屬鱗翅目Lepidoptera 菜蛾科Plutellidae，是為害十字花科蔬菜的一種重要世界性害蟲，亦是抗藥性最嚴重的蔬菜害蟲之一，常對十字花科蔬菜的生產(chǎn)造成毀滅性破壞(Sarfraz et al.，2005)。在我國，隨著大量化學殺蟲劑的廣泛使用和濫用，其抗藥性水平不斷提高，幾乎對所用過的殺蟲劑都產(chǎn)生了較高的抗藥性，嚴重威脅著十字花科蔬菜的安全生產(chǎn)和發(fā)展。抗藥性機理的闡明是抗性早期監(jiān)測和治理措施研究的基礎，對制定科學合理的用藥策略具有重要的理論意義和生產(chǎn)價值。昆蟲對殺蟲劑抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展是其為適應環(huán)境而不斷改變自身行為及抗性基因不斷選擇的結果，往往涉及到一系列蛋白質的表達調控和相互作用。從蛋白質組學的角度分析調控抗藥性的基因，將有利于從蛋白質錯綜復雜的互作關系中探索抗藥性機制，為抗性治理措施的研究提供基礎。

蛋白質組學是研究昆蟲細胞組成與功能，免疫反應復雜性的重要途徑(劉凱于等，2006)。廣泛應用于昆蟲發(fā)育生物學、免疫學、抗藥性機理、寄生蟲與寄主互作機理等領域的研究(Biron et al.，2005;李凱等，2005)。作為篩選、鑒定抗性相關蛋白的常用技術(Zhang and Guo，2011)，蛋白質組學可以從差異蛋白質組水平全面展示抗性形成和發(fā)展過程中昆蟲體內蛋白質錯綜復雜的變化情況，但其分析結果容易受到多方面因素的影響，尤其是前期處理，蛋白質的提取方法對實驗分析結果影響很大(黃艷紅等，2012)。為建立適用于小菜蛾抗藥性機理蛋白質組學研究的蛋白質提取方法，本研究比較了TCA-丙酮沉淀法，Tris-飽和酚抽提法和兩種直接裂解法，并針對具體的研究材料作了相應修改，以便為小菜蛾抗藥性機制的蛋白質組學研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試昆蟲:小菜蛾采自廣東惠州，人工氣候室(溫度24℃±1℃，光周期16L∶8D，相對濕度60%-80%)飼養(yǎng)。每個處理收集3 齡小菜蛾幼蟲50 頭，4 次重復，稱重后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白質樣品的制備

1.2.1 TCA-丙酮沉淀法

參考Salekdeh et al.(2002)方法，取凍存的3 齡小菜蛾幼蟲放入預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，懸浮于10 倍樣品提取液(10% TAC-丙酮溶液，40 mM DTT)中，4℃沉淀過夜，4℃、15000 r/min 離心30 min，棄上清。沉淀用10 倍體積的預冷含有10 mM DTT 丙酮溶液重懸，彈勻，4℃、15000 r/min 離心10 min，重復試驗步驟重懸于冰丙酮2 次，干燥3 min。離心結束后加入蛋白樣品裂解液(7 M 尿素，2 M 硫脲，4% CHAPS，2%兩性電解質，40 mM DTT，1 mM PMSF)，超聲5 min，4℃放置2 h，直至蛋白質粉末充分溶解，然后4℃、15000 r/min 離心30 min，取上清。

1.2.2 Tris-飽和酚抽提法

參考Xie 等人改良的飽和酚沉淀法(2009)，取凍存的3 齡小菜蛾幼蟲放入預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。加入1 mL 冰預冷的10%TCA 和2% B-巰基乙醇的丙酮溶液中，充分振蕩后，4℃、15000 r/min 離心5 min，棄上清，沉淀用0.1 M 的醋酸銨/80%甲醇溶液洗滌1 次，再用80%的冷丙酮溶液洗滌1 次，沉淀室溫干燥2 min。加入等體積的Tris-飽和酚溶液和dense SDS buffer(0.1 M pH 8.8 Tris-HCl，2% SDS，2% β-巰基乙醇，30% 蔗糖，1 mM PMSF)，混勻震蕩溫育5 min，4℃、15000 r/min 離心10 min，取酚層加入5 倍體積的0.1 M 的乙酸銨-甲醇溶液，-20℃沉淀過夜。然后4℃、15000 r/min 離心10 min，棄上清，沉淀用冷甲醇和80%丙酮洗滌2-3 次，真空離心干燥后加入蛋白樣品裂解液(7 M 尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，2% 兩性電解質，40 mM DTT，1 mM PMSF)，超聲5 min，4℃放置2 h，直至蛋白質粉末充分溶解，然后4℃、15000 r/min離心30 min，取上清。

1.2.3 直接裂解法

取凍存的3 齡小菜蛾幼蟲2 份分別放入預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，采用2種蛋白裂解液(RIPA Lysis Buffer，I-PER Reagent)直接裂解蛋白。具體方法為取一份研磨好的蛋白粉末加入預冷的1 mL RIPA Lysis Buffer 混懸后，于4℃靜置2 h，4℃、15000 r/min 離心30 min，取上清。取另一份研磨好的蛋白粉末加入預冷的1 mL I-PER Reagent 混懸后，于冰上靜置10 min，4℃、15000 r/min 離心15 min，取上清。

1.3 蛋白樣品的定量

樣品蛋白濃度采用全波長酶標儀(Thermo Multiskan Spectrum)進行測定。TCA-丙酮沉淀法，Tris-飽和酚抽提法以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用Bradford 法進行定量(Bradford，1976)。兩種直接裂解法采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒進行定量。

1.4 SDS-PAGE 分析

SDS-PAGE 電泳所用分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。每條泳道蛋白質樣品上樣量20 ug。電泳條件為200 V，45 min，考馬斯亮藍R-250染色。脫色至背景透明后用光密度掃描儀GS 800 掃描，利用Quantity One 軟件進行圖像分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質標準曲線

2.1.1 牛血清白蛋白標準曲線

TCA-丙酮沉淀法、Tris-飽和酚抽提法提取的蛋白定量以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用Bradford 法建立標準曲線，所得標準曲線如圖1 所示。其曲線方程為y=14.43x-0.1177，線性相關系數(shù)R2為0.9936，說明該曲線可信度較高，可以作為蛋白濃度測定的依據(jù)。

2.1.2 BCA 蛋白質標準曲線

圖1 Bradford 法蛋白標準曲線Fig.1 Protein standard curve of Bradford

兩種直接裂解法提取的蛋白質濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定，所得標準曲線如圖2所示。其曲線方程為y=1487.4x-23.384，線性相關系數(shù)R2為0.9969，說明該曲線可信度較高，可以作為蛋白濃度測定的依據(jù)。

圖2 BCA 法蛋白標準曲線Fig.2 Protein standard curve of BCA

2.2 蛋白質樣品溶解性與純度

TCA-丙酮沉淀法所提取的蛋白干燥后為淡褐色沉淀，加入蛋白裂解液后，呈淡黃色溶液，并有白色不溶物出現(xiàn)，溶解性較低;Tris-飽和酚抽提法所提取的蛋白干燥后為白色沉淀，加入蛋白裂解液后為無色澄清液體，蛋白溶解性強，純度高;直接裂解法所提取的蛋白為淡綠色澄清溶液，溶解性強，但其中含有色素等雜質，蛋白純度相對較低。

2.3 蛋白提取率的比較

4種方法對小菜蛾全蛋白的提取率如圖3 所示。其中直接裂解法RIPA Lysis Buffer 對蛋白的提取率最高，為52.06 mg/g，其次為I-PER Reagent提取率為46.16 mg/g，常用的TCA-丙酮法提取率為34.58 mg/g，最后為Tris-飽和酚抽提法，提取率為27.39 mg/g。利用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，采用LSD，S-N-K 和Duncan 三種多重比較方法，對4種方法的蛋白提取率進行方差分析。其中兩種直接裂解法與TCA-丙酮法，Tris-飽和酚抽提法的蛋白提取率差異顯著(P＜0.01)，直接裂解法中RIPA Lysis Buffer 與I-PER Reagent 法蛋白提取率差異不顯著(P＞0.05)，TCA-丙酮法與Tris-飽和酚抽提法的蛋白提取率差異也不顯著(P＞0.05)。

圖3 不同提取方法的蛋白產(chǎn)率Fig.3 The rate of protein extraction from different methods

2.4 蛋白質樣品的SDS-PAGE 電泳圖譜分析

對4種方法提取的小菜蛾全蛋白進行SDS-PAGE 電泳，并利用Quantity One 軟件對凝膠圖譜進行分析，結果如圖4 所示。Tris-飽和酚抽提法得到的蛋白譜帶數(shù)目最多，為32 條，在17.0 kDa-245 kDa 的范圍內分布均勻，且條帶清晰。TCA-丙酮法得到的蛋白譜帶為30 條，但與Tris-飽和酚抽提法相比，在90.0 kDa-240.0 kDa 范圍內缺失部分蛋白。兩種直接裂解法雖然蛋白提取量高，但得到的蛋白譜帶數(shù)目較少，其中I-PER Reagent 法有20 條，在75 kDa 附近蛋白表達量較大，蛋白條帶不易清晰辨別;RIPA Lysis Buffer 法有17 條，大部分為高分子蛋白，小分子蛋白條帶缺失明顯。

圖4 不同方法提取蛋白的SDS-PAGE 圖譜Fig.4 The SDS-PAGE map of different protein extraction methods

3 結論與討論

蛋白質提取率高，電泳條帶豐富、清晰的提取方法是蛋白質組學研究中理想的前處理措施。在小菜蛾血淋巴蛋白質組學的研究中，TCA-丙酮法提取蛋白損失少，圖譜均勻清晰，重復性好(蔡未來等，2011)。本研究中利用TCA-丙酮法提取的小菜蛾蛋白質具有提取率適中，SDS-PAGE 電泳蛋白條帶數(shù)量較多，分辨率清晰，容易操作耗時少等優(yōu)點。這可能與TCA-丙酮法中的蛋白酶抑制劑TCA 可有效抑制蛋白酶對蛋白質的水解，丙酮以及加入的DTT 可以去除樣品中酚類，脂類及色素等干擾物質，提高蛋白條帶背景的清晰度有關(林金科等，2003;Saravanan and Rose，2004;陳晶瑜等，2010)。

Tris-飽和酚抽提法，經(jīng)過改良后，有效的利用TCA 與丙酮去除樣品中的酚類，脂類及色素等干擾物質，再經(jīng)過酚的抽提去除多糖，制備的蛋白溶解性強，SDS-PAGE 電泳蛋白條帶數(shù)量多，分辨率高。但是具有蛋白提取率相對較低，酚的毒性和腐蝕性較大，操作繁瑣，耗時長等缺點(賴童飛等，2009)。

兩種直接裂解法提取小菜蛾蛋白時具有提取率高、操作簡便、耗時少等優(yōu)勢，但所提取蛋白含有較多的色素、脂類等雜質，嚴重影響了蛋白條帶的清晰度，同時亦損失了較多的小分子蛋白質，且提取試劑售價較高，增加了相應的實驗成本。

綜合分析，本研究所測試的四種蛋白質提取法中，TCA-丙酮法提取小菜蛾蛋白質具有提取率適中，蛋白質溶解性強，電泳條帶數(shù)量較多、分辨率高，譜帶清晰等優(yōu)點，適合小菜蛾的蛋白質提取，將為小菜蛾抗性機制相關的蛋白組學相關研究提供幫助。

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